Nanotransportador de ferritina activado por pH permite liberación controlada de resveratrol para quimioterapia tumoral dirigida

Resumen

En este informe, presentamos un sistema de ensamblaje reversible inducido por pH (PIRAS) basado en ferritina (Ft) para terapia tumoral dirigida. Se ha desarrollado para cargar y liberar fácilmente el fármaco anticancerígeno resveratrol (RV), basándose en su sensibilidad natural al pH y cavidad hueca única de Ft. Un péptido diana tumoral específico Arg-Gly-Asp (RGD) se conjugó en la superficie de Ft cargado con RV (RV@Ft), para formar nanopartículas biocompatibles (RV@Ft-RGD). La sensibilidad al pH de Ft le permite desnaturalizarse en nanoesfera porosa hueca bajo condición ácida y renaturalizarse en nanoesfera hueca sellada bajo condición neutra. Usando manipulación de pH, RV@Ft-RGD, con ~21 nm de diámetro, mostró alta ratio de carga de RV del 79,6 %. La liberación de RV activada por pH se midió luego en ratio del 50,3 % a pH 5,0 en 24 h. Bajo condición neutra, RV@Ft-RGD mostró excelente estabilidad por más de 20 días. La imagen de fluorescencia confocal mostró que RV@Ft-RGD tenía alta ratio de captación celular y co-localización con el lisosoma, principalmente debido al efecto diana mediado por RGD. Basado en la alta carga de fármaco, liberación activada por pH, y efecto de direccionamiento a células tumorales, RV@Ft-RGD mostró gran capacidad de eliminación celular in vitro e in vivo. La biocompatibilidad in vitro e in vivo también se demostró excelente, sin toxicidad sistémica. El concepto de diseño de PIRAS basado en Ft inhibe significativamente el crecimiento tumoral y amplía simultáneamente la aplicación de Ft en nanomedicina.

Introducción

El cáncer de pulmón es uno de los tumores sólidos más mortales en humanos. Con el deterioro creciente del ambiente y otros factores, la incidencia de cáncer de pulmón ha aumentado año a año, y su tasa de supervivencia a 5 años es solo 17,4 %. Actualmente, aunque tratamientos clínicos tradicionales como resección quirúrgica, radioterapia y quimioterapia estándar de primera línea están disponibles, la tasa de supervivencia global media de pacientes con cáncer de pulmón aún necesita mejorarse. Por tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más efectivos y seguros para curar esta enfermedad mortal. Actualmente, aunque los bajos efectos diana y altos efectos secundarios de muchos fármacos quimioterapéuticos han limitado su utilidad en quimioterapia, nuevos agentes quimioterapéuticos se desarrollan constantemente, especialmente en el campo emergente de nano-fármacos. El resveratrol (RV) es un extracto de plantas naturales como uvas y soja, ampliamente usado en entornos clínicos para promover agregación plaquetaria, inhibición de vasodilatación, reducción de viscosidad sanguínea, etc. En años recientes, también se ha encontrado que tiene fuerte efecto anticancerígeno. Sin embargo, como potencial fármaco de molécula pequeña, RV también tiene desventajas como otros fármacos quimioterapéuticos de primera línea —como mala solubilidad, vida media corta de circulación sanguínea, y falta de selectividad tumoral. Nano-fármacos basados en RV se han desarrollado en años recientes para superar estos inconvenientes y mejorar sus efectos terapéuticos. Varios tipos de nanotransportadores se han usado para cargar RV, incluyendo liposomas, albúmina sérica, materiales de carbono, dicalcogenuros de metales de transición bidimensionales (2D-TMDs), y otros. Aunque estos nanotransportadores se han reportado para mejorar eficientemente los efectos terapéuticos de RV, aún muestran algunas deficiencias —como capacidad de liberación activada de alta eficiencia para liposomas y albúmina sérica, y potencial toxicidad sistémica a largo plazo para materiales de carbono y 2D-TMDs. Por tanto, aún hay demanda de nanotransportadores más calificados.

La ferritina es una nanocápsula proteica natural con un lumen de ~8 nm, formada por la interacción y ensamblaje de 24 subunidades de cadenas pesadas y ligeras. Al ser una proteína endógena, la ferritina tiene excelente biocompatibilidad y seguridad. Además, hay un reporte de que la ferritina es una proteína naturalmente sensible al pH que puede desnaturalizarse y reensamblarse reversiblemente al cambiar su ambiente de ácido a alcalino. Cuando el pH era ácido, los oligómeros varilla desensamblados recuperaron solo la estructura en forma de cabeza, y los intermediarios desensamblados en forma de cabeza recuperaron solo la estructura esférica hueca. Este comportamiento único de ensamblaje y desensamblaje activado por pH hace de la ferritina un sistema ideal de administración de fármacos. Recientemente, Zhang et al. reportaron que moléculas de doxorrubicina (DOX) pueden encapsularse en ferritina y liberarse exitosamente por regulación de pH para terapia tumoral.

En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un sistema de ensamblaje reversible inducido por pH (PIRAS) basado en ferritina para controlar la carga y liberación de RV para quimioterapia tumoral dirigida mejorada. La superficie de la esfera de ferritina se enlazó con el péptido diana tumoral RGD. El nano-fármaco resultante RV@Ft-RGD se demostró estable en ambientes neutros y alcalinos (pH > 7,4), y solo libera RV en ambientes ácidos (pH < 7,4). Al caracterizarlo más, RV@Ft-RGD mostró los siguientes beneficios in vitro e in vivo: (1) RV@Ft-RGD dirigía células tumorales y se acumulaba en el lisosoma (ambiente ácido), donde facilitaba la liberación de más RV al citoplasma; (2) el transportador de ferritina aumentó significativamente la vida media sanguínea de RV libre, mejorando la retención del fármaco en la circulación sistémica para facilitar la acumulación de fármacos en sitios tumorales; (3) la estabilidad arquitectónica de la ferritina previno fuga explosiva de RV durante el proceso de administración; (4) RV@Ft-RGD mostró gran biocompatibilidad in vitro e in vivo. Por tanto, gracias a estos méritos, RV@Ft-RGD mostró espléndidas propiedades antitumorales terapéuticas, con gran potencial para futuras traducciones clínicas.

Materiales y Métodos

Materiales

Ferritina, resveratrol (RV, ≥99 %) fueron de Sigma-Aldrich. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), e isotiocianato de fluoresceína (FITC) se compraron de Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd (Shanghai, China). NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD se compró de Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, China). Medios de cultivo celular DMEM, suero fetal bovino (FBS), y solución salina fosfatada tamponada (PBS) se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kit de conteo celular-8 (CCK-8) fue suministrado por Dojindo Laboratories (Japón).

Síntesis de RV@Ft-RGD

La carga de RV se preparó como se describe según reporte previo con modificaciones. Primero, NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD (10 mg) se dispersó en solución de Ft (1,5 mg/mL) en presencia de 20 μL EDC (5 mg/mL) y 20 μL NHS (20 mg/mL). La mezcla reaccionó 2 h a 4 °C con agitación suave, y se purificó por diálisis contra agua destilada (corte MW = 5 kDa) durante la noche, resultando en nanopartículas Ft-RGD. Luego, RV insoluble en agua se disolvió en DMSO a 2 mg/mL y se añadió a la solución Ft-RGD con concentración final de 1,5 mg/mL. El pH de la mezcla se ajustó a pH = 5 para desensamblar las subunidades polipeptídicas. Después, el pH de la mezcla se ajustó lentamente a 7,4 con hidróxido de sodio (1 M) para reensamblar las subunidades polipeptídicas. La solución resultante se dializó en agua destilada durante la noche para eliminar moléculas de RV libres y obtener el producto final (RV@Ft-RGD). La cantidad de RV cargada se detectó por espectrofotómetro UV-vis (UV3100, Shimadzu, Japón) monitoreando el pico de absorción a 306 nm. La ratio de carga de RV fue (A_a − A_b)/A_c, donde A_a, A_b, y A_c representan el peso del RV inicial, RV no cargado y Ft-RGD, respectivamente.

Caracterizaciones

El método de dispersión dinámica de luz (DLS, BI-9000AT, Brookhaven, USA) se usó para detectar tamaño y potencial zeta de las nanopartículas. La morfología de las nanopartículas se observó por microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM-100S, JEOL, Japón). Los espectros de fluorescencia se detectaron por espectrofotómetro de luminiscencia Perkin-Elmer LS50B. La señal de fluorescencia celular se registró por microscopio láser de barrido comercial (LSM 510, Zeiss, Alemania) y citometría de flujo (FCM, EPICS XL, Beckman, USA).

Estudio de Liberación de RV

Quinientos microlitros de solución RV@Ft-RGD se colocaron en un tubo-D (MWCO 6–8 kDa, Novagen), y la solución se ajustó a diferentes valores de pH vía diferentes tampones. La solución se dializó luego a 37 °C. Tras diferentes tiempos de incubación, se retiraron alícuotas de 1 mL de diálisis y se reemplazaron con 1 mL de medio fresco. El RV liberado en diferentes tiempos de incubación se determinó por espectrofotómetro UV-vis. Adicionalmente, RV@Ft-RGD se disolvió en solución de lavado con diferentes condiciones de pH, incluyendo pH 5, 6,5, 7,4 y 8,5. Tras incubación a 37 °C por 24 h, el tamaño de las nanopartículas se caracterizó por DLS.

Cultivo Celular

Las células de cáncer de pulmón humano A549 y NCI-H358 se obtuvieron de la Colección Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China), y se cultivaron en medio DMEM conteniendo 10 % suero fetal bovino (FBS) y 1 % penicilina estreptomicina (PS) en atmósfera humidificada conteniendo 5 % CO₂ a 37 °C.

Captación Celular y Localización de RV@Ft-RGD

Como método común, FITC se aplicó para marcar las nanopartículas. FITC se disolvió en solución de etanol (2,0 mg/mL) y se mezcló con soluciones acuosas de RV@Ft y RV@Ft-RGD (1,0 mg/mL) bajo agitación de 4 h en ambiente oscuro a temperatura ambiente. La mezcla se dializó en agua destilada durante la noche para eliminar FITC y etanol redundantes, resultando en soluciones de RV@Ft y RV@Ft-RGD marcadas con FITC. Para confirmar la localización de orgánulos de nanopartículas in vitro, las células tratadas con RV@Ft y RV@Ft-RGD marcados con FITC por 5 h se tiñeron con tinte específico de lisosoma Lyso Tracker Red (Invitrogen). Después, la internalización celular de RV@Ft y RV@Ft-RGD se observó usando microscopio láser de barrido confocal (CLSM). En breve, células A549 se incubaron con RV@Ft y RV@Ft-RGD marcados con FITC (con misma concentración de FITC) por 5 h. Luego, las células se trataron con soluciones Lyso Tracker Red (100 nM) a 37 °C por 30 min. Tras lavado con PBS tres veces, las células se observaron por microscopio láser de barrido comercial. El software ImageJ se usó para analizar la intensidad de fluorescencia de las células.

Estudio de Quimioterapia Tumoral In Vitro y Apoptosis

Primero, la citotoxicidad del transportador Ft-RGD se evaluó por ensayo estándar CCK-8 (Bestbio, China). Células A549 y NCI-H358 (1 × 10⁵ células/mL, 0,5 mL) se sembraron en placa de 96 pozos y cultivaron 24 h. Tras desechar el medio viejo, medio fresco conteniendo 0, 0,01, 0,1, 0,5 y 1 mg/mL de Ft-RGD se incubó con células A549 y NCI-H358 por 24 h. Las células se lavaron suavemente tres veces con PBS. Cien microlitros de solución de trabajo CCK-8 (10 % CCK-8 + 90 % DMEM) se añadieron a cada pozo e incubaron 30 min a 37 °C. Los valores de absorbancia a 450 nm se midieron usando espectrofotómetro de microplacas (Multiskan FC, Thermo Scientific). Fotografías de cada grupo de células se observaron con microscopio óptico (Olympus).

Diversas concentraciones de RV libre, RV@Ft, RV@Ft-RGD, y RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 y 40 μg/mL equivalentes RV) se trataron con células A549. Tras 24 h incubación, la viabilidad de células tratadas se analizó por ensayo CCK-8. Simultáneamente, estas células tratadas se tiñeron dualmente por kit de detección de apoptosis (Annexin V-FITC/PI) y analizaron por FCM.

Tiempo de Circulación de RV@Ft-RGD en Sangre

RV libre o RV@Ft-RGD (6 mg/kg equivalente RV) se inyectó por vía intravenosa en ratones Balb/c nude sanos (n = 5 por grupo). Tras la inyección, la sangre venosa de los ratones se recolectó en diferentes puntos de tiempo y se colocó en tubo de recolección de sangre conteniendo heparina, y luego se separó el plasma. La concentración de RV en plasma se extrajo por reactivo de isopropanol acidificado, y luego su absorbancia a 306 nm de excitación se midió para determinar la concentración de RV.

Modelo Animal y Quimioterapia Tumoral In Vivo

Ratones Balb/c (4–6 semanas) usados en este trabajo se compraron de Charles River Laboratories (Beijing, China). Todas las operaciones involucrando experimentos con animales se realizaron estrictamente de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La directriz fue aprobada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhengzhou. Para establecer un modelo de tumor subcutáneo de A549, 2 × 10⁶ células A549 se inyectaron subcutáneamente en la espalda de los ratones. Luego se colocaron en la casa de animales por 7 a 9 días. La fórmula de cálculo de volumen tumoral es largo × ancho²/2.

Ratones portadores de tumores A549 se dividieron aleatoriamente en cinco grupos. Cada grupo consistió en cinco ratones. Los agrupamientos específicos son control (salino), RV, RV@Ft, y RV@Ft-RGD. Al inicio del tratamiento, la muestra se inyectó una vez al día por vena caudal por tres días consecutivos. Volumen tumoral y peso corporal de ratones se registraron cada 5 días. Tras 45 días de tratamiento, tumores de cada grupo se recolectaron. Los tejidos tumorales se fijaron en solución de formalina al 10 %, seccionaron, y luego se sometieron a tinción hematoxilina-eosina (H&E).

Biocompatibilidad In Vivo

Doscientos microlitros de RV@Ft-RGD se inyectaron en ratones Balb/c sanos por vena caudal (dosis RV 15 mg/kg). Ratones sanos inyectados con suero fisiológico de la misma manera se usaron como grupo control en blanco. En días 0, 10 y 45 tras la inyección, se recolectó sangre de ratón para evaluación de conteos celulares incluyendo glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC), hemoglobina (HGB), y volumen plaquetario medio (MPV), hemoglobina corpuscular media (MCH), hematocrito (HCT), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), volumen corpuscular medio (MCV), y plaquetas (PLT). Además, tejidos de corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón de cada grupo se recolectaron para tinción H&E en el día 45.

Análisis Estadístico

Los datos se presentaron como media ± desviación estándar (d.e.). El análisis estadístico de las muestras se realizó usando prueba t de Student, y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterizaciones de RV@Ft-RGD

La carga y liberación de RV desde RV@Ft-RGD se realizó vía desensamblaje y reensamblaje reversible inducido por pH de Ft (Fig. 1). Primero, la ferritina se conjugó con el péptido diana tumoral RGD para formar Ft-RGD. Esto se redisolvió luego en tampón de acetato (pH = 5) para desensamblar las subunidades polipeptídicas y formar esfera porosa hueca. Las moléculas de RV se añadieron luego y se permitieron entrar en la cavidad, tras lo cual la solución se ajustó lentamente a pH ≈ 7,4 para reensamblar Ft, atrapando las moléculas de RV dentro de la cavidad Ft sellada. Cuando el pH del tampón se disminuyó luego a ~5, los poros de la nanopartícula se abrieron reversiblemente y liberaron sus moléculas de RV. La Figura 2a y Archivo Adicional 1: Figura S1 muestran las imágenes SEM y TEM del RV@Ft-RGD ensamblado, que mostraron estructura esférica. Según análisis DLS, las partículas RV@Ft-RGD tuvieron diámetros mayores (~22,5 nm) comparadas a nanopartículas Ft crudas (~11,8 nm) (Fig. 2b) y tuvieron potenciales zeta similares a nanopartículas Ft crudas (−29,6 mV) (Fig. 2c). Tras 20 días, el índice de polidispersidad (PDI) de RV@Ft-RGD en agua, FBS, medio celular, y PBS no mostró cambio significativo (Fig. 2d), indicando que RV@Ft-RGD tenía notable estabilidad coloidal. La Figura 2e muestra los espectros de absorbancia de RV libre, Ft-RGD, y RV@Ft-RGD. Como se ve, comparado con el de RV y Ft-RGD, el espectro de absorción de RV@Ft-RGD exhibió un nuevo pico a 306 nm (originado de RV), indicando la carga exitosa de RV. Además, RV@Ft-RGD mostró fluorescencia de emisión significativa similar a RV libre a 400 nm, cuando excitado por láser de 325 nm (Fig. 2f).

Carga y Liberación de Fármaco

La capacidad máxima de carga de Ft-RGD se encontró en 252,6 %, probablemente debido a la gran cavidad dentro del Ft-RGD hueco. Al ser Ft sensible al pH, pudimos caracterizar la capacidad de carga de RV bajo diferentes condiciones de pH. Como se muestra en Fig. 3a, con el aumento de pH de 5,0 a 8,5, la eficiencia de carga de RV disminuyó drásticamente. La liberación de RV del complejo también se caracterizó bajo diferentes valores de pH de 5,0 a 8,5. Un perfil de liberación de RV dependiente de pH y tiempo se construyó a partir de estos datos y se muestra en Fig. 3b. La ratio máxima de liberación de fármaco (51,6 %) ocurrió en pH = 5,0 por 24 h, mayor que en pH = 6,5, 7,4 y 8,5. Según reportes relacionados, los valores de pH de 5,0, 6,5 y 7,4 son los típicamente encontrados en lisosomas celulares, tejidos tumorales, sangre, y ambiente fisiológico normal, respectivamente. Bajo condición fisiológica (pH 7,4), el contenido de fármaco RV de RV@Ft-RGD permaneció alto incluso tras 50 h (Fig. 3c), sugiriendo que el RV en RV@Ft-RGD es estable y no se filtra fácilmente. Además, investigamos el cambio en diámetro de RV@Ft-RGD bajo varias condiciones de pH diferentes. Tras incubación a 37 °C por 12 h, análisis DLS mostró que el diámetro de RV@Ft-RGD fue casi constante, ~23 nm a pH 8,5 y 7,4. Cuando el valor de pH bajó a 6,5 y 5,0, el diámetro de RV@Ft-RGD aumentó a 25 nm y 28,6 nm respectivamente (Fig. 3d). Estos resultados confirman el comportamiento de desensamblaje y reensamblaje reversible inducido por pH de RV@Ft-RGD, benéfico para carga controlada de fármaco in vitro y liberación en tejido tumoral.

Captación Celular In Vitro y Localización

La captación celular in vitro y localización de RV@Ft-RGD se evaluó luego. Primero, RV@Ft y RV@Ft-RGD se marcaron con FITC vía interacción de enlace de hidrógeno y absorción física. Como se muestra en Fig. 4a, células tratadas con FITC libre mostraron señales de fluorescencia citoplasmática insignificantes. Las células tratadas con RV@Ft-RGD, por el contrario, mostraron intensa fluorescencia verde FITC, mayor que la de células tratadas con RV@Ft. Notablemente, células tratadas con RV@Ft-RGD y pre-tratadas con RGD ambas mostraron baja fluorescencia verde. De estos resultados, concluimos que RV@Ft-RGD fue captado por células en altas cantidades, probablemente mediante efecto diana activo mediado por RGD. Estas células tratadas también se analizaron por FCM, cuyos resultados se muestran en Fig. 4b. Los resultados estadísticos de intensidad de fluorescencia celular sugieren conclusión similar.

Para estudiar la localización de orgánulos de RV@Ft-RGD, se usó un tinte de tinción específico de lisosoma (Lyso Tracker Red) para teñir las células incubadas con las nanopartículas. Como se ve en Fig. 4a, el citoplasma mostró fuerte fluorescencia roja en todos los grupos. Tras fusionar con fluorescencia verde FITC, RV@Ft-RGD mostró la más intensa fluorescencia amarilla (verde + rojo) en el citoplasma entre estos grupos. Basado en análisis estadístico, el grupo tratado con RV@Ft-RGD tuvo el coeficiente de co-localización más alto entre fluorescencia FITC y Lyso Tracker Red (Fig. 4c). Estos resultados indican que RV@Ft-RGD puede entrar activamente en células y luego transferirse al ambiente ácido del lisosoma (pH ≈ 5,0). Estos méritos, junto con la liberación de fármaco sensible al pH, dotan a RV@Ft-RGD de muchas aplicaciones potenciales para terapia tumoral in vivo.

Biocompatibilidad In Vitro y Terapia Tumoral

Antes de estudiar las propiedades antitumorales de RV@Ft-RGD, se investigó la citotoxicidad del transportador Ft-RGD. Como se muestra en Fig. 5a y Archivo Adicional 1: Figuras S2 y S3, Ft-RGD no mostró supresión obvia de viabilidad a células de cáncer de pulmón A549 y NCI-H358 a concentraciones hasta 1 mg/mL. La morfología celular tampoco exhibió cambio significativo cuando las células tratadas con 1 mg/mL se compararon a grupos control (Fig. 5b), sugiriendo claramente que Ft-RGD como transportador tenía excelente biocompatibilidad. Como se muestra en Fig. 6a, b, RV libre, RV@Ft, y RV@Ft-RGD matan células de manera dependiente de concentración. Las células tratadas con RV@Ft-RGD mostraron mayor disminución de viabilidad y solo tuvieron 11,2 % viabilidad celular en grupos 40 μg/mL, menor que grupos RV@Ft y RV@Ft-RGD + RGD pre-tratados. Un estudio preliminar con FCM reveló además que con RV solo, RV@Ft, o RV@Ft-RGD, la mayoría de las muertes celulares fue mediada vía apoptosis (Fig. 6c). Estos resultados demuestran que el efecto de eliminación de células tumorales de RV se mejoró grandemente al cargar en Ft-RGD, principalmente debido a la mayor acumulación de RV@Ft-RGD en el lisosoma, donde la condición de pH ácido activó una mayor liberación de RV promotor de apoptosis al citoplasma.

Vida Media Sanguínea de RV@Ft-RGD

La concentración de RV en plasma sanguíneo en diferentes tiempos post-inyección se estudió en grupos tratados con RV libre y RV@Ft-RGD, respectivamente. Como se muestra en Fig. 7a, la vida media sanguínea de RV@Ft-RGD fue 5,1 ± 0,23 h. RV libre tuvo una eliminación más rápida de la circulación, con vida media sanguínea de solo 0,43 ± 0,11 h. La vida media significativamente extendida de RV@Ft-RGD en sangre es benéfica para mejorar la retención del fármaco en la circulación sistémica y facilita la acumulación de fármacos en sitios tumorales.

Efecto Antitumoral In Vivo y Toxicidad Sistémica de RV@Ft-RGD

La Figura 7b muestra el perfil de crecimiento tumoral de ratones portadores de tumor con diferentes tratamientos, expresado como volumen tumoral relativo. El crecimiento tumoral se inhibió en cierto grado al tratar con RV@Ft, probablemente debido a la baja captación de RV@Ft. Sin embargo, en el grupo tratado con RV@Ft-RGD, el crecimiento tumoral se suprimió significativamente comparado a los otros grupos (control, RV, RV@Ft, y RV@Ft-RGD + RGD). Durante el tratamiento, no hubo pérdida notable de peso corporal en ningún grupo experimental (Fig. 7c), indicando la alta bioseguridad de RV@Ft-RGD. Al final del tratamiento, se realizó tinción H&E de tejido tumoral en estos grupos para investigar los efectos quimioterapéuticos. Como se muestra en Fig. 7d, se observó gran área de apoptosis en tumores tratados con RV@Ft-RGD, en contraste significativo con solo pequeña área de apoptosis en tumores tratados con RV libre, RV@Ft, y RV@Ft-RGD + RGD. Además, la toxicidad sistémica de RV@Ft-RGD también se evaluó en ratones normales. Muestras de sangre total de ratones sanos tratados con salino y RV@Ft-RGD se recolectaron a 0, 10 y 45 días post-inyección para análisis de sangre. Como se muestra en Fig. 8a, b, los conteos sanguíneos completos (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT, y MCHC) de ratones inyectados con RV@Ft-RGD no mostraron diferencias significativas del día 0 al 45. Los órganos principales de ratones sanos tratados con salino y RV@Ft-RGD también se recolectaron a 45 días para tinción H&E. No se encontraron efectos secundarios obvios en estos tejidos (Fig. 8c), sugiriendo toxicidad adversa a largo plazo insignificante. Todos estos resultados demuestran el potencial prometedor de RV@Ft-RGD para quimioterapia anticancerígena mejorada in vivo.

Conclusión

En resumen, hemos desarrollado exitosamente un sistema de ensamblaje reversible inducido por pH (PIRAS) con carga y liberación controlables por pH del fármaco antitumoral RV para quimioterapia tumoral dirigida mejorada. Bajo condición ácida (pH = 5,0), el sistema puede desensamblar y cargar o liberar RV, mientras que bajo condición neutra (pH = 7,4), RV@Ft-RGD es altamente estable y muestra fuga de fármaco insignificante. A través del efecto diana mediado por RGD, RV@Ft-RGD puede ser captado en altas concentraciones por células A549 y acumularse en el lisosoma, benéfico para liberación de RV tanto in vitro como in vivo. Debido a la acumulación de RV@Ft-RGD en el lisosoma, y la liberación de RV activada por pH ácido del lisosoma al citoplasma, RV@Ft-RGD mostró excelentes efectos de eliminación de células tumorales y promoción de apoptosis comparado a RV libre. Además, tras la carga de RV en Ft-RGD, RV@Ft-RGD mostró vida media sanguínea mucho más larga que RV libre. Los resultados in vivo demuestran que RV@Ft-RGD muestra supresión tumoral notable y ninguna toxicidad sistémica notable. Este estudio sugiere que PIRAS basado en Ft es altamente eficiente en carga y liberación de fármaco para terapia anticancerígena mejorada.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Las conclusiones hechas en este manuscrito se basan en los datos que todos se presentan y muestran en este artículo.

Abreviaturas

BSA:

Albúmina sérica bovina

CCK-8:

Kit de conteo celular-8

DLS:

Dispersión dinámica de luz

EDC:

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

FBS:

Suero fetal bovino

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

Ft:

Ferritina

HCT:

Hematocrito

HGB:

Hemoglobina

MCH:

Hemoglobina corpuscular media

MCHC:

Concentración de hemoglobina corpuscular media

MCV:

Volumen corpuscular medio

MPV:

Volumen plaquetario medio

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PIRAS:

Sistema de ensamblaje reversible inducido por pH

PLT:

Plaquetas

RBC:

Glóbulos rojos

RGD:

Arg-Gly-Asp

RV:

Resveratrol

WBC:

Glóbulo blanco