Un sistema de ensamblaje reversible inducido por pH con carga y liberación controlable por resveratrol para una quimioterapia mejorada dirigida a los tumores

Resultados y discusión

Síntesis y caracterizaciones de RV @ Ft-RGD

La carga y liberación de RV de RV @ Ft-RGD se llevó a cabo mediante el desmontaje reversible inducido por pH y el reensamblaje de Ft (Fig. 1). En primer lugar, la ferritina se conjugó con el péptido RGD dirigido a tumores para formar Ft-RGD. A continuación, se volvió a disolver en un tampón de acetato (pH =5) para desmontar las subunidades polipeptídicas y formar una esfera hueca con poros. Luego se agregaron moléculas de RV y se dejaron entrar en la cavidad, después de lo cual la solución se ajustó lentamente a pH 7,4 para reensamblar Ft, atrapando las moléculas de RV dentro de la cavidad sellada de Ft. Cuando el pH del tampón se redujo a ~ 5, los poros de las nanopartículas se abrieron de manera reversible y liberaron sus moléculas de RV. Figura 2a y archivo adicional 1:La figura S1 muestra las imágenes SEM y TEM del RV @ Ft-RGD ensamblado, que muestra una estructura esférica. Según el análisis DLS, las partículas RV @ Ft-RGD tenían diámetros más grandes (~ 22,5 nm) en comparación con las nanopartículas de Ft sin procesar (~ 11,8 nm) (Fig.2b) y tenían potenciales zeta similares a las nanopartículas de Ft sin procesar (- 29,6 mV) (Fig. . 2c). Después de 20 días, el índice de polidispersidad (PDI) de RV @ Ft-RGD en agua, FBS, medio celular y PBS no mostró cambios significativos (Fig. 2d), lo que indica que RV @ Ft-RGD tenía una estabilidad coloidal notable. La Figura 2e muestra los espectros de absorbancia de RV, Ft-RGD y RV @ Ft-RGD libres. Como puede verse, comparado con el de RV y Ft-RGD, el espectro de absorción de RV @ Ft-RGD exhibió un nuevo pico a 306 nm (originado en RV), lo que indica la carga exitosa de RV. Además, RV @ Ft-RGD mostró una emisión de fluorescencia significativa similar a la del RV libre a 400 nm, cuando se excitó con un láser de 325 nm (Fig. 2f).

Una ilustración esquemática de la preparación de RV @ Ft-RGD y la quimioterapia dirigida al tumor

un La imagen TEM de RV @ Ft-RGD. b , c La distribución de tamaño y la distribución de potencial zeta de Ft-RGD y RV @ Ft-RGD. d El cambio de PDI del RV @ Ft-RGD en agua, FBS, medio celular y PBS durante 20 días. e Los espectros de absorbancia de RV libre, Ft-RGD y RV @ Ft-RGD. f Los espectros de absorbancia de RV y RV libres @ Ft-RGD

Carga y liberación de medicamentos

Se encontró que la capacidad de carga máxima de Ft-RGD era del 252,6%, probablemente debido a la gran cavidad dentro del hueco Ft-RGD. Como Ft es sensible al pH, pudimos caracterizar la capacidad de carga del RV en diferentes condiciones de pH. Como se muestra en la Fig. 3a, con el aumento del pH de 5,0 a 8,5, la eficiencia de carga del RV disminuyó drásticamente. La liberación de RV del complejo también se caracterizó bajo diferentes valores de pH de 5,0 a 8,5. Se construyó un perfil de liberación de RV dependiente del valor del pH y del tiempo a partir de estos datos y se muestra en la Fig. 3b. La proporción máxima de liberación de fármaco (51,6%) ocurrió en pH =5,0 durante 24 h, que fue más alta que en pH =6,5, 7,4 y 8,5. Según informes relacionados, los valores de pH de 5,0, 6,5 y 7,4 son los que se encuentran típicamente en los lisosomas celulares, los tejidos tumorales, la sangre y el entorno fisiológico normal, respectivamente [31]. En condiciones fisiológicas (pH 7,4), el contenido de fármaco RV de RV @ Ft-RGD permaneció alto incluso después de 50 h (Fig. 3c), lo que sugiere que el RV en RV @ Ft-RGD es estable y no se filtra fácilmente. Además, investigamos el cambio de diámetro de RV @ Ft-RGD en varias condiciones de pH diferentes. Después de la incubación a 37 ° C durante 12 h, el análisis DLS mostró que el diámetro de RV @ Ft-RGD era casi constante, alrededor de 23 nm a pH 8.5 y 7.4. Cuando el valor de pH se redujo a 6,5 ​​y 5,0, el diámetro de RV @ Ft-RGD aumentó a 25 nm y 28,6 nm respectivamente (Fig. 3d). Estos resultados confirman el comportamiento del desmontaje y reensamblaje reversible inducido por pH de RV @ Ft-RGD, que es beneficioso para la carga controlable del fármaco in vitro y la liberación del fármaco en el tejido tumoral.

un Eficiencia de carga de Ft-RGD en diversas condiciones de pH. b Perfil de liberación de RV de RV @ Ft-RGD en varias condiciones de pH de 5,0 a 8,5. c El RV permanente en RV @ Ft-RGD en condición fisiológica. d El cambio de tamaño promedio de RV @ Ft-RGD en varias condiciones de pH de 5.0 a 8.5

Captación y localización celular in vitro

Luego se evaluó la captación celular in vitro y la localización de RV @ Ft-RGD. En primer lugar, RV @ Ft y RV @ Ft-RGD fueron marcados por FITC mediante la interacción del enlace de hidrógeno y la absorción física. Como se muestra en la Fig. 4a, las células tratadas con FITC libres mostraron señales de fluorescencia citoplásmica insignificantes. Las células tratadas con RV @ Ft-RGD, por el contrario, mostraron una intensa fluorescencia verde FITC, que fue más alta que la de las células tratadas con RV @ Ft. En particular, las células tratadas con RV @ Ft-RGD y las células pretratadas con RGD mostraron una fluorescencia verde baja. A partir de estos resultados, podemos concluir que RV @ Ft-RGD fue absorbido por las células en grandes cantidades, probablemente a través de un efecto objetivo activo mediado por RGD. Estas células tratadas también se analizaron mediante FCM, cuyos resultados se muestran en la Fig. 4b. Los resultados estadísticos de la intensidad de la fluorescencia celular sugieren una conclusión similar.

un Imágenes de fluorescencia de células A549 después de la incubación con RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD y RV @ Ft-RGD libres marcados con FITC y FITC, respectivamente. Barra de escala =60 μm. b Medición FCM de las intensidades de fluorescencia celular de FITC en células A549 después de la incubación con RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD y RV @ Ft-RGD libres marcados con FITC y FITC, respectivamente. c Coeficiente de co-localización de fluorescencia celular de FITC y Lyso Tracker Red. ** P <0.01, en comparación con otros grupos, respectivamente

Para estudiar la localización de orgánulos de RV @ Ft-RGD, se utilizó un tinte de tinción específico de lisosoma (Lyso Tracker Red) para teñir las células incubadas con las nanopartículas. Como puede verse en la Fig. 4a, el citoplasma mostró una fuerte fluorescencia roja en todos los grupos. Después de fusionarse con la fluorescencia verde FITC, RV @ Ft-RGD mostró una fluorescencia amarilla (verde + rojo) más intensa en el citoplasma entre estos grupos. Según el análisis estadístico, el grupo tratado con RV @ Ft-RGD tuvo el coeficiente de colocalización más alto entre FITC y la fluorescencia roja Lyso Tracker (Fig. 4c). Estos resultados indican que RV @ Ft-RGD puede entrar activamente en las células y luego ser transferido al ambiente ácido del lisosoma (pH ≈ 5,0). Estos méritos, junto con la liberación del fármaco sensible al pH, otorgan a RV @ Ft-RGD muchas aplicaciones potenciales para la terapia de tumores in vivo.

Biocompatibilidad in vitro y terapia tumoral

Antes de estudiar las propiedades antitumorales de RV @ Ft-RGD, se investigó la citotoxicidad del portador de Ft-RGD. Como se muestra en la Fig. 5a y el archivo adicional 1:Figuras S2 y S3, Ft-RGD no mostró una supresión de viabilidad obvia para las células A549 de cáncer de pulmón y las células NCI-H358 en concentraciones de hasta 1 mg / ml. La morfología celular tampoco mostró cambios significativos cuando se compararon las células tratadas con 1 mg / ml con los grupos de control (Fig. 5b), lo que sugiere claramente que Ft-RGD como portador tenía una excelente biocompatibilidad. Como se muestra en la Fig. 6a, b, RV, RV @ Ft y RV @ Ft-RGD libres matan todas las células de una manera dependiente de la concentración. Las células tratadas con RV @ Ft-RGD mostraron una mayor disminución de la viabilidad y solo tuvieron una viabilidad celular del 11,2% en los grupos de 40 μg / mL, que fue menor que los grupos pretratados con RV @ Ft y RV @ Ft-RGD + RGD. Un estudio preliminar con FCM reveló además que con RV solo, RV @ Ft o RV @ Ft-RGD, la mayoría de las muertes celulares estaban mediadas por apoptosis (Fig. 6c). Estos resultados demuestran que el efecto de destrucción de las células tumorales de RV se incrementó en gran medida al cargarse en Ft-RGD, principalmente debido a una mayor acumulación de RV @ Ft-RGD en el lisosoma, donde la condición de pH ácido desencadenó una mayor liberación de RV que promueve la apoptosis. en el citoplasma [32, 33].

un Citotoxicidad in vitro contra células A549 tratadas con diferente concentración de Ft-RGD durante 24 h. b La imagen microscópica de células A549 después de 24 h de tratamiento con 1 mg / mL de Ft-RGD

un Viabilidad celular de diferentes concentraciones de células A549 tratadas con RV. b Viabilidad celular de las células tratadas con RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD y RV @ Ft-RGD con diversas concentraciones de RV. c Apoptosis celular de células A549 tratadas con PBS (control), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD y RV @ Ft-RGD mediante citometría de flujo. ** P <0.01, en comparación con otros grupos, respectivamente

Vida media en sangre de RV @ Ft-RGD

Se estudió la concentración de RV en el plasma sanguíneo en diferentes momentos después de la inyección en los grupos tratados con RV libre y RV @ Ft-RGD, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 7a, la vida media en sangre de RV @ Ft-RGD fue de 5,1 ± 0,23 h. El RV libre tuvo un lavado más rápido de la circulación, con una vida media en sangre de solo 0,43 ± 0,11 h. La vida media significativamente prolongada de RV @ Ft-RGD en la sangre es beneficiosa para mejorar la retención de fármacos en la circulación sistémica y facilita la acumulación de fármacos en los sitios del tumor.

un Tiempo de circulación de RV y RV libres @ Ft-RGD en sangre. b El perfil de crecimiento de tumores con xenoinjerto A549 después de tres inyecciones intravenosas de solución salina (control), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD y RV @ Ft-RGD. La flecha roja indica el momento de la inyección. ** P <0,01, en comparación con otros grupos, respectivamente. c Peso corporal de ratones portadores de tumores después de varios tratamientos. d Micrografías de cortes tumorales teñidos con H &E recolectados de diferentes grupos de ratones después del final del tratamiento. Las barras de escala son de 50 μm

Efecto antitumoral in vivo y toxicidad sistémica de RV @ Ft-RGD

La Figura 7b muestra el perfil de crecimiento tumoral de ratones portadores de tumores con diferentes tratamientos, que se expresó como volumen tumoral relativo. El crecimiento tumoral se inhibió hasta cierto punto cuando se trató con RV @ Ft, probablemente debido a la baja absorción de RV @ Ft. Sin embargo, en el grupo tratado con RV @ Ft-RGD, el crecimiento tumoral se suprimió significativamente en comparación con los otros grupos (control, RV, RV @ Ft y RV @ Ft-RGD + RGD). Durante el tratamiento, no hubo una pérdida notable de peso corporal en ningún grupo experimental (Fig. 7c), lo que indica la alta bioseguridad de RV @ Ft-RGD. Después del final del curso de tratamiento, se realizó la tinción H&E del tejido tumoral en estos grupos para investigar los efectos quimioterapéuticos. Como se muestra en la Fig.7d, se observó una gran área de apoptosis en los tumores tratados con RV @ Ft-RGD, que contrasta significativamente con solo un área pequeña de apoptosis en los tumores tratados con RV, RV @ Ft y RV @ libres. Ft-RGD + RGD. Además, también se evaluó la toxicidad sistémica de RV @ Ft-RGD en ratones normales. Se recogieron muestras de sangre completa de ratones sanos tratados con solución salina y RV @ Ft-RGD a los 0, 10 y 45 días después de la inyección para análisis de sangre. Como se muestra en la Fig.8a, b, los recuentos sanguíneos completos (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT y MCHC) de ratones inyectados con RV @ Ft-RGD no mostraron diferencias significativas desde el día 0 hasta el 45 días. Los órganos principales de ratones sanos tratados con solución salina y RV @ Ft-RGD también se recolectaron a los 45 días para la tinción con H&E. No se encontraron efectos secundarios obvios en estos tejidos (Fig. 8c), lo que sugiere una toxicidad adversa a largo plazo insignificante. Todos estos resultados demuestran el potencial prometedor de RV @ Ft-RGD para mejorar la quimioterapia contra el cáncer in vivo.

un Análisis de sangre de ratones sanos tratados con RV @ Ft-RGD durante 45 días. b Imágenes de órganos principales teñidos con H &E de ratones sanos tratados con RV @ Ft-RGD durante 45 días. c La tinción HE muestra los órganos principales en los grupos de control y tratados con RV @ Ft-RGD. Las barras de escala son de 50 μm