Estudio experimental de etosomas encapsulados de 5-fluorouracilo combinados con láser fraccional de CO2 para tratar cicatrices hipertróficas
Resumen
Objetivo
Este estudio está diseñado para explorar la permeabilidad de los etosomas encapsulados con 5-florouracilo (5-FU) mediado por CO 2 láser fraccional sobre tejidos cicatriciales hipertróficos. Además, el efecto terapéutico y de duración del CO 2 Se evaluará el láser fraccional combinado con etosomas encapsulados en 5-FU en un modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo.
Métodos
La cantidad permeada de 5-FU y los contenidos de retención de 5-FU se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Las intensidades de fluorescencia de los etosomas encapsulados con 5-FU (5E) marcado con Rodanmin 6GO (Rho) se midieron mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). La promoción de la permeabilidad de 5E marcado con Rho en cicatriz hipertrófica de oreja de conejo mediada por CO 2 El láser fraccional se evaluó a las 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 días y 7 días después de la irradiación. Las tasas de apertura de los microcanales se calcularon según CLSM. El efecto terapéutico de 5EL se evaluó en la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo in vivo. El grosor relativo de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo antes y después del tratamiento se midió mediante el método del calibre. El índice de elevación de la cicatriz (SEI) de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo se midió mediante tinción H&E.
Resultados
Los datos mostraron que la cantidad de penetración del grupo 5EL fue superior a la del grupo 5E (4,15 ± 2,22 frente a 0,73 ± 0,33; p <0,05) después de 1 h de tratamiento. Además, la cantidad de penetración de 5EL fue mayor que la del grupo 5E (107,61 ± 13,27 frente a 20,73 ± 3,77; p <0,05) después de 24 h de tratamiento. El contenido de retención del grupo 5EL también mostró un nivel superior al del grupo 5E (24,42 ± 4,37 frente a 12,25 ± 1,64; p <0,05). La intensidad de fluorescencia de Rho en los tejidos de cicatriz hipertrófica del grupo 5EL fue mayor que la del grupo 5E en diferentes puntos de tiempo (1, 6 y 24 h). Las velocidades de apertura de los microcanales se redujeron gradualmente en 24 h, y los microcanales se cerraron por completo 3 días después de la irradiación con CO 2 láser fraccional. El grosor relativo y el SEI de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo después de 7 días de tratamiento en el grupo 5EL fueron significativamente más bajos que en el grupo 5E.
Conclusión
CO 2 El láser fraccionado combinado con 5E tópico puede ser eficaz en el tratamiento de la cicatriz hipertrófica in vivo y proporcionar un método de terapia novedoso para la cicatriz hipertrófica humana.
Antecedentes
La cicatriz hipertrófica es una afección cutánea caracterizada por depósitos de cantidades excesivas de colágeno que da lugar a una cicatriz elevada, pero que no alcanza el grado observado de queloides [1]. Un total de 100 millones de pacientes desarrollaron cicatrices en los países desarrollados cada año, como resultado de 55 millones de operaciones electivas y 25 millones de operaciones después de un trauma [2]. Después de la operación quirúrgica, alrededor del 60% de los pacientes desarrollaron cicatrices hipertróficas en el posoperatorio, típicamente durante los primeros 3 meses. La mayoría de las cicatrices hipertróficas siguen siendo hipertróficas 12 meses después de las operaciones quirúrgicas [3]. Actualmente, los métodos de tratamiento comunes incluyen tratamientos quirúrgicos y no quirúrgicos. La presión, la radioterapia, la quimioterapia y otros tratamientos quirúrgicos con medicamentos son el tratamiento terapéutico principal. Hasta ahora, estas terapias no pudieron lograr el efecto terapéutico deseado debido a sus defectos [4, 5]. La farmacoterapia es uno de los tratamientos no quirúrgicos más habituales para la cicatrización patológica de la pintura exterior basada en inyecciones locales. Debido a los efectos secundarios de los medicamentos, las inyecciones locales a menudo se limitan a tratamientos a pequeña escala y en dosis bajas. Además, debido a la corta vida media del fármaco, las inyecciones locales del fármaco no siempre lograron mantener altas concentraciones duraderas en la cicatriz; por lo tanto, a menudo se necesitan inyecciones repetidas [6]. Teniendo en cuenta la densidad del tejido cicatricial y el dolor intenso, la inyección no es generalmente aceptable para los pacientes. A pesar de las ventajas que incluyen indoloro, sin efectos secundarios en el hígado y convenientes para el uso externo a largo plazo [7, 8], los medicamentos no pueden entrar en la cicatriz debido a la estructura organizativa especial de las cicatrices patológicas. Informes recientes también indicaron que la medicación tópica es difícil de penetrar en el tejido cicatricial [9]. Por lo tanto, el uso externo de medicamentos es limitado actualmente.
Los etosomas son un nuevo portador de lípidos utilizado por Touitou en 2000 [10], eficaz para administrar fármacos a través de la piel. El componente principal de los etosomas es el etanol, que puede cambiar la disposición ajustada de las moléculas de lípidos de la cutícula, mejorar la fluidez de los lípidos y promover la flexibilidad y movilidad de la membrana del liposoma del etanol. El etanol de los etosomas también puede acelerar la deformación del estrato córneo y mejorar su capacidad de transporte y penetración del fármaco a través del estrato córneo desordenado de la piel [11,12,13]. Sin embargo, al ser diferente del tejido cutáneo normal, el tejido cicatricial tiene una estructura especial. En nuestro estudio anterior, demostramos que los etosomas son un portador muy eficaz de fármacos en cicatrices humanas [14]. Es indispensable que el fármaco en el tejido cicatricial no esté bien distribuido, sino que disminuya significativamente desde el exterior hacia el interior de la piel. El fármaco se acumula principalmente en la epidermis y la capa superficial de la dermis, pero no en todas las capas de la dermis, lo que disminuye el efecto anti-cicatrices.
La terapia con láser fraccionado ablativo, una tecnología cosmética, es una modalidad muy popular y ampliamente aceptada actualmente y se utiliza principalmente para el tratamiento clínico de arrugas faciales, cicatrices superficiales, trastornos de la pigmentación y mejora de la textura de la piel [15,16,17]. Basado en la teoría de la fototermólisis de matriz de puntos [18], el láser fraccional ablativo produce una disposición en forma de matriz de un rayo láser diminuto y rompe la barrera cutánea al crear canales verticales microscópicos ablativos rodeados por una zona de daño térmico, lo que induce una respuesta de curación de heridas a la piel moderada apariencia [19,20,21,22]. Se ha informado de que la principal barrera de absorción percutánea del fármaco es el estrato córneo [23, 24]. Estudios recientes han demostrado que, uno de los láseres fraccionales ablativos clínicos más utilizados, el CO 2 El láser fraccional puede descomponer el estrato córneo y formar canales microporosos densos, lo que socava la principal barrera que impide la absorción percutánea del fármaco y brinda una buena penetración transdérmica que promueve las perspectivas [25,26,27,28].
En este estudio, exploramos CO 2 gel etosomal fraccionado mediado por láser que lleva el fármaco anti-cicatrices 5-florouracilo (5-FU) en muestras de cicatrices humanas y modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo. Usando este nuevo enfoque, nos enfocamos en mejorar la eficiencia de la administración de medicamentos anti-cicatrices para acortar el proceso de tratamiento de cicatrices largas. Por primera vez, se aplicó el modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo para determinar el CO 2 Etosomas a nanoescala fraccionados mediados por láser que llevan 5-FU sobre cicatrices hipertróficas y efecto de penetración de fármacos. Juntos, se ha sugerido que CO 2 El láser fraccional combinado con un fármaco tópico proporciona un método terapéutico novedoso para la cicatriz hipertrófica humana.
Métodos
Etosomas encapsulados de 5-FU
El método de Touitou [10] se utilizó como preparación para etosomas encapsulados en 5-FU. La distribución del tamaño de partículas de 25 ° C y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron utilizando un analizador de tamaño de partículas láser ( λ =632,8 nm). PDI <0,1 indica la distribución uniforme del tamaño de partícula, y PDI> 0,3 sugiere una distribución del tamaño de partícula no homogénea. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para la observación de la morfología de los etosomas. En este estudio se utilizó el método de ultracentrifugación [29] para medir la eficiencia de encapsulación (EE) de los etosomas.
Cromatografía líquida de alto rendimiento
La concentración de 5-FU en el compartimento receptor de las células de Franz se determinó mediante un sistema de HPLC Waters 2695 (Meadows Instrumentation, Illinois) y un detector ultravioleta 2487 con una columna Diamonsil TM C18 de fase inversa (250 mm × 4,6 mm, 5 μm ). Se detectó 5-FU a 265 nm con una fase móvil de metanol – H 2 O (5:95 v / v ) a un caudal de 1 ml / min. Los datos se analizaron por área de pico y el método estándar externo, utilizando un sistema Waters Empower.
Microscopía de escaneo láser confocal
El tejido cicatricial hipertrófico humano se analizó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM) en incrementos de 10 µm. La intensidad de la fluorescencia se analizó usando un microscopio de barrido láser LSM 510 (Zeiss, Jena, Alemania) con una lente de objetivo de apertura numérica Fluar 10x, 0,5. La excitación óptica se llevó a cabo con un láser HeNe de 543 nm y la emisión de fluorescencia se detectó por encima de 560 nm para la rodamina 6GO (Rho). Las imágenes se analizaron mediante el software de análisis de imágenes Release Version 4.0 SP2 para calcular la distribución de la fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia de los tejidos cicatriciales. En 10 × 10 veces el campo de visión, el tamaño y la distribución de los valores de los píxeles fue para determinar el rango de penetración de 5-FU EG (etiquetado con Rho) y mediante un método semicuantitativo.
Ensayo de permeabilidad de etosomas de 5-FU en tejido cicatricial humano
Las muestras de cicatrices hipertróficas humanas del Noveno Hospital Popular de Cirugía Plástica afiliado a la Universidad Jiaotong de Shanghai proceden de la escisión de cicatrices en pacientes con tres casos, todas mujeres, de 21 a 35 años de edad; la cicatriz está ubicada en el hombro y la espalda; curso de cicatriz hipertrófica de 6 meses a 1 año; integridad del tejido cicatricial; sin ulceración; sin lesiones infecciosas; y la cicatriz más baja también debe ser más alta que la piel, y el paciente no ha recibido ningún tratamiento desde la enfermedad. Se utilizó anestesia general para eliminar el efecto de los anestésicos locales sobre el tejido cicatricial. Las muestras obtenidas se retiraron inmediatamente del tejido subcutáneo, protegieron la epidermis, se hicieron con un grosor de 4.0 mm, un área de muestras de tejido cicatricial de 3 cm × 3 cm, se lavaron con solución salina a temperatura ambiente, se secaron con una gasa de superficie seca, se envolvieron con papel de aluminio y conservar en nevera a - 20 ° C. El tejido cicatricial hipertrófico humano se extrajo y se almacenó en un congelador a -20 ° C antes de su uso. Se sumergió tejido cicatricial hipertrófico humano en PBS a pH 7,4 a 25ºC durante 2 h, y el agua de la superficie del tejido se eliminó suavemente con una gasa seca. Todas las regiones de tejido epidérmico de tejido cicatricial hipertrófico eran CO 2 irradiado con láser fraccional. Los parámetros láser son seguidos inmediatamente por el modo DeepFX, densidad de energía de 25 mj, cobertura del 20%, frecuencia de emisión de 300 Hz, en el décimo tamaño de punto y sin superposición. Todas las muestras irradiadas se recogieron mediante detección por HPLC para determinar el contenido de tejido cicatricial de 5-FU. Las secciones histopatológicas se utilizan inmediatamente para el ensayo CLSM.
Modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo
El método del modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo se describió brevemente a continuación:12 conejos blancos de Nueva Zelanda, machos, y que pesaban 2 kg (SLAC, Shanghai) se alojaron por separado durante 2 semanas. Para la anestesia de conejos, se mezcló lumianning con 1,5 mg de ketamina por 100 g de peso mediante inyección intramuscular. Todas las heridas estaban rodeadas por el punto central de las orejas de conejo. Cada herida redonda con un diámetro de 1 cm estaba defectuosa, y luego se eliminó el pericondrio. Veintiocho días después de la cirugía, la oreja de conejo se desprendió de la herida y se curó por completo, con un diámetro visible de aproximadamente 0,9 cm de cicatrices hipertróficas. La cicatriz era de color rojo brillante, había protuberancias en la piel alrededor de la hiperplasia obvia y la cicatriz era gruesa y dura.
Determinación de las tasas de apertura de los microcanales
Diferentes puntos de tiempo después de CO 2 tratamiento con láser fraccional en modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo, se aplicó Rodanmin 6GO de fluorescencia roja con etosomas a los tejidos de la cicatriz. Tres horas más tarde, se utilizó CLSM para determinar la tasa de apertura del canal. Tasa de apertura de canal =número de canal abierto / (número de canal abierto + número de canal cerrado) × 100%. El porcentaje de la tasa de apertura del canal refleja el efecto del CO 2 efectividad fraccionada de la penetración del láser.
Tinción H&E
Generalmente, los conejos se sacrifican usando pentobarbital al 10% i.v. inyección (dosis 5 veces superior a la dosis normal para anestesia, 35 mg / kg). Retire inmediatamente las muestras y continúe con el paso de tinción H&E. El método de tinción con hematoxilina y eosina se realiza de acuerdo con el protocolo de tinción estándar H&E.
Índice de elevación de la cicatriz y determinación del espesor relativo
Veintiocho días después de la inducción de cicatrices hipertróficas de oreja de conejo, se realizan cuatro grupos de intervención:Grupo 5EL:geles entosomales encapsulados con 5-FU combinado con CO 2 láser fraccional; Grupo 5E:los geles entosomales encapsulados con 5-FU; CO 2 grupo:CO 2 tratamiento con láser fraccionado; y grupo de control. Definimos A como el grosor de la parte más gruesa del tejido cicatricial hipertrófico de la oreja de conejo y B como el grosor de 1,0 cm de distancia de la parte más gruesa del tejido cicatricial hipertrófico de la oreja de conejo (cerca del punto central). El espesor relativo se calcula mediante A / B. La hipertrofia de la cicatriz dérmica fue ilustrada por el SEI. SEI =el área de la dermis recién formada / el área de la dermis no lesionada. SEI> 1.5 representa una cicatriz hipertrófica.
Estadísticas
Todos los experimentos se repitieron tres veces. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó con SPSS versión 19.0 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). t del estudiante Se utilizó la prueba para calcular la significancia. * p valor <0,05 se consideró estadísticamente significativo; ** p valor <0,01 se consideró estadísticamente muy significativo; *** p valor <0,001 se consideró estadísticamente extremadamente significativo, y **** p valor <0,0001 se consideró estadísticamente muy extremadamente significativo.
Resultados
Evaluación de la calidad de los etosomas encapsulados con 5-florouracilo (5E)
En primer lugar, para validar la calidad del gel etosomal encapsulado con 5-florouracilo (5E), se detectaron la morfología y los diámetros mediante observación con microscopio electrónico de transmisión (TEM). Los etosomas en estado de suspensión formaron un círculo completo de tamaño universal o una vesícula ovalada-esférica, que es menor de 100 nm bajo un microscopio (Fig. 1a-b). Después de la formulación en gel, los etosomas permanecieron intactos (Fig. 1c-d). Usando un analizador de tamaño de partículas láser, los etosomas en estado de suspensión parecen tener un diámetro de 87,72 ± 9,27 nm, y el PDI fue 0,10 ± 0,01. Mientras tanto, el tamaño de partícula de los etosomas fue de 98,78 ± 10,88 nm y el PDI fue de 0,11 ± 0,02. Una comparación estática muestra que el tamaño de partícula no tiene una diferencia significativa ( p > 0,05). Además, ambos PDI no tuvieron diferencias significativas ( p > 0,05). Además, los datos obtenidos del analizador de tamaño de partículas láser y TEM mostraron resultados comparables. Además, la eficacia de atrapamiento (EE) también se determinó mediante el método de ultracentrifugación (Tabla 1). Los resultados mostraron que la EE de la suspensión de etosoma fue de 10,47 ± 1,47% y la EE del gel de etosoma fue de 11,56 ± 1,12% ( n =6), sin importancia ( p > 0,05). En conclusión, no se encontraron cambios en la morfología ni en el tamaño de las partículas en el estado de suspensión ni en el estado de gel de los etosomas.
Imágenes de microscopio electrónico de transmisión de etosomas de 5-FU. Etosomas de soluciones ( a y b ) y etosomas de gel ( c y d )
CO 2 El láser fraccional promueve la permeabilidad 5E a través de cicatrices hipertróficas in vitro
Después de evaluar la calidad de los etosomas encapsulados con 5-florouracilo (5-FU), exploramos su permeabilidad en cicatrices hipertróficas humanas con o sin CO 2 láser fraccional in vitro . El tejido cicatricial hipertrófico humano fue irradiado por CO 2 láser fraccional y luego 5E se aplicó uniformemente. Las concentraciones acumulativas de 5-FU se determinaron a 1, 3, 6, 10, 16 y 24 h por HPLC (2). Comparamos las concentraciones acumuladas de 5-FU de CO 2 láser fraccional combinado con etosomas encapsulados con el grupo 5-florouracilo (5EL) y el grupo 5E en diferentes momentos. A 1 h, la concentración acumulada de 5-FU del grupo 5EL fue de 4,15 ± 2,22 μg / ml / cm 2 , que fue superior a la concentración del grupo 5E (0,73 ± 0,33 μg / ml / cm 2 , p <0,001). En el tratamiento a largo plazo (24 h), la concentración de permeación acumulada de 5-FU del grupo 5EL (107,61 ± 13,27 μg / ml / cm 2 ) también fue superior a la del grupo 5E (20,73 ± 3,77 μg / ml / cm 2 , p <0,0001). En los puntos de tiempo anteriores, 3, 6, 10 y 16 h, los grupos de 5EL siempre mostraron una concentración de permeación acumulativa de 5-FU más alta que los grupos de 5E (Fig. 2a). Además, la cantidad de retención de 5-FU en el grupo de 5EL fue de 24,42 ± 4,37 μg / cm 2 , que es superior al grupo 5E (12,45 ± 1,64 μg / cm 2 , p <0.01, n =6) (Figura 2b). Este resultado sugirió que CO 2 La irradiación láser fraccionada puede promover significativamente el liposoma contenido en 5-FU a través del tejido cicatricial hipertrófico humano y ayudar a la retención de 5-FU en el tejido cicatricial hipertrófico in vitro.
CO 2 El láser fraccional promueve la permeabilidad 5E a través de cicatrices hipertróficas in vitro . un Comparación de la permeación del grupo 5E y 5EL en un estudio de 24 h de cicatriz hipertrófica humana in vitro. Los valores se expresaron como la media ± DE. n =6. b La retención acumulativa de 5-FU en cicatriz hipertrófica in vitro después de la aplicación durante 24 h. n =6. *** p valor <0.001 se consideró estadísticamente extremadamente significativo, **** p valor <0,0001 se consideró estadísticamente altamente extremadamente significativo
La profundidad y el alcance de la penetración del 5-FU se determinaron utilizando 5E marcado con Rho para evaluar el efecto de mejora de la penetración del CO 2 láser fraccionado in vitro. Se utilizó un ensayo de fluorescencia para indicar la intensidad de los grupos 5E y 5EL a 1, 6 y 24 h después del tratamiento con 5-FU (Fig. 3a). Los resultados mostraron que después de 1 h de tratamiento con 5EL, la fluorescencia de Rho se distribuyó en la capa superficial de la epidermis y la dermis, especialmente alrededor de CO 2 Zona de gasificación fraccionada inducida por láser. Por el contrario, sin CO 2 irradiación láser fraccionada, la distribución de fluorescencia Rho se limitó al área de la epidermis en el grupo 5E. Después de 6 h de tratamiento en el grupo 5EL, la fluorescencia de Rho se expandió a la dermis profunda y exhibió más acumulación. Aunque la distribución de fluorescencia del grupo 5E comenzó a aparecer en la dermis, la intensidad de la fluorescencia disminuyó de la dermis a la epidermis gradualmente. Después de 24 h de tratamiento, la fluorescencia de dos grupos se distribuyó ampliamente en todo el tejido cutáneo, pero la intensidad de la fluorescencia en el grupo 5EL fue significativamente mayor. Además, se utilizó el software de análisis de imágenes Release Version 4.0 SP2 para el análisis cuantitativo para calcular la intensidad de la fluorescencia para ambos grupos. Los resultados del análisis cuantitativo mostraron un aumento significativo de la intensidad de la fluorescencia de Rho en el grupo 5EL que en el grupo 5E (1 h:59,61 ± 6,39 frente a 6,39 ± 1,64, p <0,0001; 6 h:163,32 ± 13,23 frente a 49,89 ± 4,01, p <0,0001; 24 h:270,36 ± 8,73vs. 148,25 ± 16,89, p <0,0001) (figura 3b). En resumen, CO 2 La irradiación láser fraccionada promueve significativamente la penetración de 5E en el tejido cicatricial hipertrófico humano in vitro.
CO 2 El láser fraccional promueve la permeabilidad a través de cicatrices hipertróficas in vitro . un La fluorescencia roja está marcada con etosomas que impregnaron tejidos de cicatrices hipertróficas después de 1, 6 y 24 h in vitro. b La intensidad de fluorescencia de los etosomas marcados con rodamina 6GO en tejido cicatricial hipertrófico in vitro después de 1, 6 y 24 h. **** p valor <0,0001 se consideró estadísticamente altamente extremadamente significativo
Duración de CO 2 El láser fraccional mejora la penetración de 5-FU in vivo
Para obtener evidencia más sustancial de CO 2 efecto láser fraccional, realizamos la penetración de 5-FU in vivo utilizando un modelo de cicatriz hipertrófica de conejo. La configuración del modelo de cicatriz hipertrófica de conejo se describió como Método. Diferentes momentos (3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 días y 7 días) después de la aplicación de CO 2 Se realizó un tratamiento con láser fraccional, 5E o 5EL y se determinó inmediatamente la distribución de fluorescencia mediante CLSM (Fig. 4). La fluorescencia de Rho era muy visible y estaba ampliamente distribuida en la capa de la dermis de las cicatrices hipertróficas de la oreja de conejo, que estaban más cerca de la zona ablativa (Fig. 4a). Estos resultados pueden indicar que Rho mezclado con 5E se infiltra principalmente a través del canal poroso después de que el CO 2 irradiación láser fraccionada. La fluorescencia se puede detectar en la zona ablativa que rodea el tejido dérmico después de 6 h 5EL, incluso con un área de distribución pequeña (Fig. 4b). El área de distribución de la fluorescencia continúa reduciéndose 12 h después del tratamiento con el fármaco, lo que indica que los canales microporosos se cierran gradualmente cuando la herida cicatriza (Fig. 4c). Después de 24 h, 3 días y 7 días de tratamiento con CO 2 irradiación láser fraccionada, la fluorescencia solo se puede encontrar dentro del poro de la corteza alrededor de las aberturas y no penetra en la dermis (Fig. 4d-f), lo que sugiere que el CO 2 El efecto de penetración fraccionada del láser ha desaparecido con la reepitelización completa de la epidermis. Nuestros datos sugirieron que la apertura de microcanales juega un papel crítico en la penetración de fármacos con el tratamiento 5EL. A partir de entonces, calculamos las tasas de apertura de microcanales de 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 días y 7 días después de la irradiación láser, respectivamente. En los puntos de tiempo de 3 y 6 h, todos los canales microporosos estaban abiertos, lo que indicaba que las tasas de apertura de los microcanales eran del 100%. Las tasas de apertura de los microcanales comenzaron a disminuir al 90,59% a las 12 hy al 15,58% a las 24 h. En particular, todos los canales microporosos se cerraron a los 3 y 7 días después del tratamiento con 5EL. En conjunto, estos resultados sugieren que el CO 2 El láser fraccional controla la penetración del fármaco en el tejido cicatricial hipertrófico del conejo in vivo.
CO 2 El láser fraccional promueve las tasas de apertura de microcanales in vivo. La fluorescencia roja está marcada con eosomas que impregnan los tejidos de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo 0 h ( a ), 6 h ( b ), 12 h ( c ), 24 h ( d ), 3 días ( e ) y 7 días ( f ) después de CO 2 tratamiento con láser fraccionado in vivo
El efecto terapéutico de 5EL en la cicatriz hipertrófica in vivo
Para comprender en profundidad el tratamiento con 5EL, realizamos la determinación del grosor relativo de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo. Después de la configuración del modelo de cicatriz hipertrófica de oreja de conejo, se calcularon los valores de espesor relativo antes y después del tratamiento con 5EL. No se encontraron diferencias significativas en los grupos antes del tratamiento. Sin embargo, el grosor relativo del grupo 5EL fue 1,27 ± 0,15, que fue significativamente más bajo que el grupo 5E (1,52 ± 0,10, p <0.05) y sin tratar (1.61 ± 0.15, p <0,0001) grupo (Fig.5). Curiosamente, no hubo cambios significativos entre el CO 2 grupo de tratamiento con láser solamente y grupo 5EL. Estos datos sugieren que CO 2 El láser fraccional juega un papel dominante en la curación de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo in vivo.
Comparación del espesor relativo de cicatrices hipertróficas de conejo antes y después de la aplicación de diferentes tratamientos. 5EL:los geles entosomales encapsulados con 5-FU combinado con CO 2 láser fraccional, n =14; CO 2 :CO 2 solo láser fraccional, n =12; Grupo 5E:los geles entosomales encapsulados con 5-FU, n =14; control:en blanco, n =16. * p valor <0,001 se consideró significativo, **** p valor <0,0001 se consideró estadísticamente altamente extremadamente significativo
También comparamos la morfología de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo para determinar la diferencia de usar CO 2 láser fraccional. En el grupo de 5EL, las cicatrices hipertróficas se aplanaron y el color se volvió significativamente rosa claro (Fig. 6a-b). En CO 2 En el grupo de tratamiento con láser fraccional solo, el grosor de la cicatriz hipertrófica disminuyó hasta cierto punto y su color se volvió rojo pálido (Fig. 6c-d). En el grupo 5E, el grosor de la cicatriz hipertrófica disminuyó ligeramente pero el color permaneció rojo brillante (fig. 6e-f). Finalmente, no hubo cambios significativos en el grupo no tratado en comparación con antes del tratamiento (Fig. 6g – h). A continuación, se utilizó tinción H&E para análisis patológico en 7 días después del tratamiento para estos cuatro grupos en tejido cicatricial hipertrófico de orejas de conejo (Fig. 7). El grupo 5EL y CO 2 Los grupos de tratamiento con láser fraccionado solo mostraron la disminución del grosor de la capa dérmica de las cicatrices hipertróficas y la costra puntiaguda con una rara disposición de fibras de colágeno de la dermis superficial nodular o en forma de espiral (Fig. 7a-b). Se encontró una gran cantidad de penetración de fibras de colágeno dérmico, disposición desordenada de las fibras de colágeno y disposición en forma de espiral o nodular de la dermis superficial en el grupo 5E y en el grupo no tratado (fig. 7c-d). Otro método de evaluación importante para la cicatriz hipertrófica es el índice de elevación de la cicatriz (SEI). Similar con el patrón de espesor relativo, SEI del grupo 5EL (1,16 ± 0,08) y CO 2 El grupo de tratamiento con láser fraccional solo (1,22 ± 0,10) disminuyó significativamente en comparación con el grupo 5E (1,32 ± 0,13) y el grupo no tratado (1,49 ± 0,08) (Fig. 8). En conjunto, el análisis de morfología y los datos de cálculo de SEI muestran CO 2 Funciones del láser fraccional en la curación de la cicatriz hipertrófica de la oreja de conejo in vivo.
Imagen fotográfica de cicatrices hipertróficas de conejo antes y después de la aplicación de diferentes tratamientos durante 7 días. El grupo 5EL:los geles entosomales encapsulados con 5-FU combinado con CO 2 láser fraccional, antes ( a ) y después ( b ) tratamiento durante 7 días; CO 2 grupo:CO 2 láser fraccional, antes ( c ) y después ( d ) tratamiento durante 7 días; 5E grupo B:los geles entosomales encapsulados con 5-FU, antes ( e ) y después ( f ) tratamiento durante 7 días; y grupo en blanco:en blanco, antes ( g ) y después ( h ) tratamiento durante 7 días
Análisis histológico H&E de cicatrices hipertróficas de conejo después de aplicar diferentes tratamientos durante 7 días. El grupo 5EL:los geles entosomales encapsulados con 5-FU combinado con CO 2 láser fraccional ( a ); CO 2 grupo:CO 2 tratamiento con láser fraccionado ( b ); Grupo 5E:los geles entosomales encapsulados con 5-FU ( c ); y grupo en blanco:en blanco ( d ). Ampliaciones originales:× 40
Comparación de SEI de cicatrices hipertróficas de conejo después de aplicar diferentes tratamientos durante 7 días. 5EL:los geles entosomales encapsulados con 5-FU combinado con CO 2 láser fraccional, n =14; CO 2 :CO 2 láser fraccional, n =12; 5E:los geles entosomales encapsulados con 5-FU, n =14; control:en blanco, n =16. *** p valor <0,001 se consideró estadísticamente extremadamente significativo y **** p valor <0,0001 se consideró estadísticamente altamente extremadamente significativo
Discusión
El tratamiento farmacológico es el enfoque de tratamiento principal, principalmente tópico o como inyecciones locales, para el tratamiento no quirúrgico de las cicatrices hipertróficas. Debido a los efectos secundarios de varios medicamentos, la inyección local a menudo se limita a pequeñas dosis y, por lo tanto, solo permite una pequeña gama de tratamientos. Además, debido a la corta vida media de los fármacos, la alta concentración persistente en la cicatriz requiere inyecciones repetidas [6, 30, 31]. Además, debido a que el tejido cicatricial está muy concentrado y con frecuencia se experimenta un dolor intenso durante las inyecciones, los pacientes a menudo no aceptan el tratamiento. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.
So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO2 fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO2 fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].
In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm 2 ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm 2 ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO2 laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO2 fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO2 fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO2 fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO2 fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.
The duration of CO2 fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO2 fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO2 laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.
In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO2 fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO2 fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.
It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO2 fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO2 fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO2 fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO2 fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15
The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].
Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO2 fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO2 fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.
Conclusion
CO2 fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO2 fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO2 fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO2 fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO2 fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO2 fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.
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