Microscopia óptica

Microscopía óptica  

La microscopía estudia la ampliación de la imagen de los objetos que son demasiado pequeños para ser vistos correctamente a simple vista. La microscopia cumple su cometido aprovechando las radiaciones (Fig. 1) emitidas, absorbidas, transmitidas o reflejadas por la muestra a observar. La naturaleza de la radiación especifica el tipo de microscopía, como microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía de rayos X o microscopía acústica, etc. La parte visible del espectro electromagnético es el tipo de radiación utilizada por la microscopía óptica. La microscopía óptica es el examen microscópico de materiales a través del microscopio óptico.

Figura 1 Ondas electromagnéticas

En la antigüedad se usaban lupas ásperas, pero la evolución de los microscopios modernos comenzó en el siglo XVII. Aunque el primer microscopio compuesto fue construido por Hans y Zacharias Janssen en 1595, Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) logró fabricar lentes tan buenos que lograron el asombroso aumento de alrededor de 300x en sus microscopios muy simples. Debido a las sugerencias del científico Robert Hook alrededor de 1670, el fabricante de instrumentos Christopher Cock en Londres construyó un microscopio compuesto muy exitoso. Con este instrumento, Hook pudo observar las células. El microscopio de Hook puede considerarse el padre de los instrumentos modernos.

El microscopio óptico, a menudo denominado "microscopio de luz", es un tipo de microscopio que utiliza luz visible (Fig. 1) y un sistema de lentes para ampliar imágenes de muestras pequeñas. Los microscopios ópticos son los más antiguos y simples de los microscopios. Es un instrumento muy importante para el estudio de la microestructura, a pesar de la evolución de los sofisticados instrumentos metalográficos de electrones. El sofisticado "microscopio electrónico de barrido" (SEM) y el "microscopio electrónico de transmisión" (TEM) también son instrumentos invaluables. Sin embargo, se deben utilizar junto con el microscopio óptico, en lugar de sustituirlos.

Todos los exámenes de la microestructura comienzan con el uso del microscopio óptico, comenzando con un aumento bajo, como 100x, seguido de aumentos progresivamente más altos para evaluar las características básicas de la microestructura de manera eficiente. La mayoría de las microestructuras se pueden observar con el microscopio óptico e identificar en función de sus características. La identificación de constituyentes dudosos o desconocidos puede ayudarse mediante la observación de su dureza en relación con la matriz, su color natural, su respuesta a la luz polarizada y su respuesta a los grabadores selectivos. Estas observaciones se comparan con los detalles conocidos sobre la metalurgia física del material que se examina. Si aún quedan dudas o si la estructura es demasiado fina para observarla, se deben implementar técnicas más sofisticadas.

El microscopio óptico se puede utilizar para examinar muestras metalográficas pulidas o grabadas. Ciertos constituyentes se observan más fácilmente como pulidos, porque no están oscurecidos por los detalles del grabado. Las inclusiones, los nitruros, ciertos carburos y las fases intermetálicas se pueden observar fácilmente sin grabado. Excepto por las inclusiones, las otras fases se pueden examinar más fácilmente si se introduce algún relieve durante el pulido final. Las muestras deben prepararse adecuadamente para garantizar la correcta observación e interpretación de la microestructura sin complicaciones por artefactos. Las muestras que responden a la luz polarizada, como los materiales con estructuras cristalinas no cúbicas, normalmente se examinan sin grabado. Sin embargo, en la mayoría de los casos, se debe realizar un grabado para observar la microestructura. Normalmente se utiliza primero un grabador de propósito general para revelar la estructura del grano y las fases presentes, seguido de grabadores selectivos que atacan o colorean fases específicas de interés. Los grabadores selectivos se utilizan ampliamente para la metalografía cuantitativa, especialmente si se realizan con un dispositivo automatizado. En cualquier caso, el grabado debe realizarse con cuidado para revelar la microestructura con claridad.

Un microscopio utiliza una lente objetivo de distancia focal muy corta para formar una imagen muy ampliada. Luego, esta imagen se ve con un ocular de distancia focal corta que se usa como una lupa simple. El concepto básico de formación de imágenes y las estructuras de la microscopía óptica se muestran en la Fig. 2. El sistema óptico de un microscopio incluye principalmente una lente objetivo y un ocular. El propósito de una lente objetivo es ampliar un objeto para que el usuario pueda observarlo claramente. Durante la observación, la muestra se coloca cerca del plano focal de la lente del objetivo en el espacio del objeto y primero se crea una imagen real ampliada de la muestra en el plano intermedio. El plano intermedio está ubicado en el plano focal del ocular, por lo que el ocular funciona como una lupa para ampliar aún más la imagen proyectada en el plano de imagen intermedio. Finalmente, se proporciona al observador una imagen invertida, virtual y ampliada.

Fig. 2 Principio óptico de las imágenes del microscopio

La capacidad de un microscopio óptico para producir imágenes separables de diferentes puntos de un objeto es limitada. El poder de resolución de una lente es una medida cuantitativa de esta capacidad. Los puntos más cercanos al límite de resolución no se pueden distinguir como puntos separados. Ernst Abbe en 1873 fijó por primera vez el valor de la distancia mínima d entre dos puntos adyacentes permitiéndoles percibirse como separados por la ecuación 'd =l/2n sin A', donde 'l' es la longitud de onda de la luz, 'A' es la mitad de la apertura angular de la lente y 'n' es el índice de refracción del medio entre el objeto y la lente.

En la actualidad, la separación lineal más pequeña de dos puntos del objeto para la que pueden resolverse mediante un objetivo está fijada por el criterio de Rayleigh dado por la ecuación 'd =1.22(l/2NA)' donde 'l' es la longitud de onda de la luz, y 'NA' es la apertura numérica del objetivo. Tanto el criterio de Abbe como el de Rayleigh son muy similares, estando la apertura numérica relacionada con el medio de imagen por NA =n sin A. El valor máximo de sinA es 1 (A =90 grados), por lo tanto, la apertura numérica máxima teórica de un objetivo en el aire (n =1) es NA =1. Dado que una AN alta es un requisito esencial para la alta resolución, se ha desarrollado la óptica de inmersión. Se pueden obtener imágenes de las muestras a una distancia muy corta del objetivo a través de medios de inmersión que tengan un índice de refracción diferente, como agua (n =1,33), glicerina (n =1,47) o aceite (n =1,52).

Para un microscopio bien diseñado, la resolución espacial está determinada principalmente por la lente del objetivo. Aunque un ocular también puede ampliar la imagen, no puede mejorar el poder de resolución de los microscopios. La resolución espacial de un microscopio óptico viene dada por la ecuación de Rayleigh Ro =0. 62 l/n sen A, donde 'Ro' es la distancia resoluble mínima, 'l' es la longitud de onda de la luz, 'n' es el índice de refracción del medio entre la lente y el objeto, y 'A' es uno -la mitad de la apertura angular de la lente, y n sinA es la apertura numérica del objetivo.

Con base en la ecuación anterior, y considerando las limitaciones prácticas, a saber (i) el uso de luz visible con una longitud de onda entre 390 nm (nanómetros) y 760 nm, (ii) la apertura máxima alcanzable con el ángulo medio de 70 grados a 75 grados, y (iii) el requisito de utilizar métodos de inmersión con agua o aceite para aumentar el índice de refracción, la resolución de un microscopio óptico convencional no puede exceder los 200 nm.

El microscopio óptico y la trayectoria de onda óptica simplificada del microscopio se muestran en la Fig. 3. El microscopio óptico moderno puede ampliar un objeto 1500 veces con el límite de 200 nm en resolución espacial. Los microscopios ópticos se pueden dividir en muchos tipos diferentes utilizando una variedad de criterios. Por ejemplo, basados ​​en un método de iluminación, existen los tipos de microscopios de transmisión y reflexión. En un microscopio de transmisión, la luz atraviesa objetos transparentes. En un microscopio de reflexión, la fuente de luz instalada en la parte superior de la lente microscópica ilumina los objetos no transparentes y la lente recoge la luz reflejada. Los microscopios también se pueden diferenciar en función de los métodos de observación, incluidos los microscopios de campo claro, los microscopios de campo oscuro, los microscopios de diferencia de fase, los microscopios de luz polarizada, los microscopios de interferencia y los microscopios fluorescentes.

Cada microscopio puede utilizar el enfoque de transmisión o el de reflexión. Los microscopios de campo claro son los más populares y ampliamente utilizados de todos los microscopios. Con este tipo de microscopio, la relación de transmisión (o absorción) y la relación de reflexión de algunos objetos observados varían según el cambio de los entornos de trabajo. La amplitud de estos objetos varía con el cambio en la intensidad de la iluminación. Los objetos transparentes e incoloros son visibles solo cuando cambia la fase de la luz iluminada. Debido a que los microscopios de campo brillante no pueden cambiar la fase de la luz, las muestras transparentes e incoloras son invisibles cuando se usa este tipo de microscopio.

Fig. 3 Microscopio óptico y su principio

Componentes del microscopio

Los microscopios ópticos varían considerablemente en costo y capacidad. La luz reflejada se utiliza para el estudio de los metales. Los microscopios de luz transmitida se utilizan para estudiar minerales y polímeros, que también se pueden examinar con luz reflejada. Los microscopios ópticos también se clasifican como "verticales" o "invertidos". Estos términos se refieren a la orientación del plano de pulido de la muestra durante la observación. Dado que cada configuración tiene ciertas ventajas y desventajas, la selección se basa en la preferencia personal. El microscopio óptico más sencillo es el de mesa (normalmente vertical). Se pueden agregar capacidades fotográficas a algunos microscopios dependiendo de la rigidez del soporte.

Están disponibles diferentes tipos de microscopios adecuados para observación y fotomicroscopía. Estos pueden ser unidades bastante simples o microscopios de investigación a gran escala con diversos modos de iluminación, fuentes de luz, accesorios de microdureza, platinas calientes, etc. Los componentes básicos del microscopio óptico se dan a continuación y se muestran en la Fig. 3.

Iluminación  sistema – Hay disponible una variedad de fuentes de luz para microscopía óptica. La lámpara de filamento de tungsteno de bajo voltaje que se usa principalmente con microscopios de banco tiene una intensidad adecuada para la observación, pero no para la fotografía. La alteración de la corriente a la bombilla controla la intensidad de la luz. Los sistemas de iluminación de arco de carbono, que alguna vez fueron comunes en los microscopios, han sido reemplazados por fuentes de luz de arco o filamento. La fuente de luz de arco de xenón prevalece debido a su alta intensidad y características de color de la luz del día. Sin embargo, la intensidad de la luz solo se puede ajustar mediante el uso de filtros de densidad neutra. Las lámparas de filamento de tungsteno-halógeno también se utilizan ampliamente por su alta intensidad y alta temperatura de color. La intensidad de la luz se puede controlar variando la corriente o mediante el uso de filtros de densidad neutra. Otras fuentes de luz, como las lámparas de arco de circonio, arco de sodio, yodo de cuarzo o vapor de mercurio, son menos comunes.

Condensador – Se coloca una lente ajustable libre de aberración esférica y coma frente a la fuente de luz para enfocar la luz en el punto deseado del camino óptico. Se coloca un diafragma de campo frente a esta lente para minimizar el deslumbramiento interno y los reflejos dentro del microscopio. El diafragma de campo se detiene hasta el borde del campo de visión. Un segundo diafragma de iris ajustable, el diafragma de apertura, se coloca en la trayectoria de la luz antes del iluminador vertical.

Abrir o cerrar este diafragma altera la cantidad de luz y el ángulo del cono de luz que ingresa a la lente del objetivo. La configuración óptima para esta apertura varía con cada lente del objetivo y es un compromiso entre el contraste de la imagen, la nitidez y la profundidad de campo. A medida que aumenta la ampliación, el diafragma de apertura se detiene. Abrir esta apertura aumenta la nitidez de la imagen, pero reduce el contraste. Cerrar la apertura aumenta el contraste, pero reduce la nitidez de la imagen. El diafragma de apertura no debe utilizarse para reducir la intensidad de la luz. Solo debe ajustarse el contraste y la nitidez.

Filtros de luz – Se utilizan para modificar la luz para facilitar la observación, para mejorar la microscopía fotográfica o para alterar el contraste. Los filtros de densidad neutra se utilizan para reducir la intensidad de la luz de manera uniforme en todo el espectro visible. Están disponibles diferentes filtros de densidad neutra desde alrededor del 85 % al 0,01 % de transmitancia. La mayoría de los microscopios ópticos tienen una selección de al menos dos de estos filtros.

Los filtros selectivos se utilizan para equilibrar la temperatura de color de la fuente de luz con la de la película. Esto suele ser necesario para la reproducción fiel de imágenes en color, según la fuente de luz utilizada y el tipo de película. Un filtro verde o amarillo-verde se usa ampliamente en la fotografía en blanco y negro para reducir el efecto de los defectos de la lente en la calidad de la imagen. La mayoría de los objetivos, particularmente los acromáticos de menor costo, necesitan dicho filtrado para obtener buenos resultados.

Los filtros polarizadores se utilizan para producir luz polarizada plana (un filtro) o luz polarizada cruzada (dos filtros rotados para producir extinción) para el examen de materiales no cúbicos (cristalográficos). Los materiales que son ópticamente anisotrópicos, como el berilio, el zirconio, el titanio alfa y el uranio, se pueden examinar en condiciones de polarización cruzada sin grabado. También se puede usar una placa de tinte sensible con luz polarizada cruzada para mejorar la coloración.

La lente del objetivo – Forma la imagen primaria de la microestructura y es el componente más importante del microscopio óptico. La lente del objetivo recoge la mayor cantidad de luz posible de la muestra y combina esta luz para producir la imagen. La NA del objetivo es una medida de la capacidad de captación de luz de la lente. La capacidad de recolección de luz aumenta con el ángulo 'A'. El ajuste del diafragma de apertura altera la NA del condensador y, por lo tanto, la NA del sistema.

Las lentes de objetivo (Fig. 4) normalmente se montan en una torreta de punta que puede aceptar de cuatro a seis objetivos. Algunos microscopios no usan torretas de punta, y solo se puede colocar un objetivo a la vez en el iluminador vertical usando una montura de bayoneta. El iluminador vertical contiene un reflector o prisma que desvía la luz por el objetivo hacia la superficie de la muestra. Normalmente también contiene los diafragmas de apertura y de campo y los filtros. El iluminador vertical normalmente proporciona solo uno o dos tipos de iluminación, como iluminación de campo brillante y de campo oscuro o iluminación de campo brillante y de luz polarizada. Sin embargo, ahora hay disponibles iluminadores verticales universales que brindan todo tipo de iluminación con un iluminador vertical y un conjunto de objetivos.

La longitud del tubo es la longitud del tubo del cuerpo desde la línea del ojo del ocular hasta la rosca del objetivo. Esta longitud no está estandarizada y puede variar. La mayoría de los objetivos están diseñados para usarse con una cierta longitud de tubo, normalmente de 160 mm a 250 mm, y normalmente no se pueden intercambiar.

El objetivo más utilizado es el acromático, que se corrige esféricamente para un color (normalmente amarillo-verde) y para la aberración cromática longitudinal para dos colores (normalmente rojo y verde). Por lo tanto, los acromáticos no son adecuados para la microscopía fotográfica en color. El uso de un filtro amarillo-verde y una película ortocromática produce resultados óptimos. Sin embargo, los acromáticos proporcionan una distancia de trabajo relativamente larga, es decir, la distancia desde la lente frontal del objetivo hasta la superficie de la muestra. La distancia de trabajo disminuye a medida que aumenta la ampliación del objetivo. La mayoría de los productores hacen objetivos de larga distancia de trabajo para aplicaciones especiales, por ejemplo, en microscopía de etapa caliente. Los acromáticos están libres de tensión, lo cual es importante para los exámenes con luz polarizada. Dado que contienen menos lentes que otras lentes con mayor corrección, las pérdidas por reflexión interna se minimizan.

Los objetivos semiapocromáticos o de fluorita proporcionan un mayor grado de corrección de la aberración esférica y cromática. Por lo tanto, producen imágenes de mayor calidad que los acromáticos. Los objetivos apocromáticos tienen el mayor grado de corrección, producen los mejores resultados y son más caros. Los objetivos plano tienen una amplia corrección para la planitud del campo, lo que reduce la fatiga visual y se encuentran con frecuencia en los microscopios modernos.

Con los sistemas de lentes parafocales, cada objetivo en la torreta del revólver está casi enfocado cuando se gira la torreta, lo que evita que la lente frontal del objetivo golpee la muestra cuando se cambian las lentes. Muchos objetivos también están accionados por resorte, lo que ayuda a evitar daños en la lente. Esto es más un problema con objetivos de gran aumento, porque la distancia de trabajo puede ser muy pequeña.

Ciertos objetivos están diseñados para usarse con aceite entre la muestra y la lente frontal del objetivo. Sin embargo, las lentes de inmersión en aceite rara vez se usan, ya que la muestra y la lente deben limpiarse después del uso. Sin embargo, proporcionan resoluciones más altas que las que se pueden lograr cuando hay aire entre la lente y la muestra. En este último caso, la NA máxima posible es de 0,95, mientras que las lentes de inmersión en aceite producen una NA de 1,3 a 1,45, dependiendo de la lente y el aceite utilizado. Están disponibles aumentos de 25x a 160x. El uso de aceite también agudiza la imagen, lo cual es valioso cuando se examinan especímenes de baja reflectividad, como carbón o cerámica.

Fig. 4 Tipos de lente objetivo y ocular

Ocular – También se le llama lente ocular. El ocular (Fig. 4) aumenta la imagen primaria producida por el objetivo. El ojo puede entonces utilizar la capacidad de resolución completa del objetivo. El microscopio produce una imagen virtual de la muestra en el punto de mayor visibilidad, normalmente a 250 mm del ojo. El ocular aumenta esta imagen, lo que permite lograr aumentos útiles. El ocular estándar tiene un campo de visión de 24 mm de diámetro, mientras que los oculares de campo amplio para objetivos planos tienen un campo de visión de 30 mm de diámetro, lo que aumenta el área útil de la imagen primaria.

El ocular más simple es el ocular Huygenian cuyo diseño fue inventado por C. Huygens. Consiste en dos lentes plano-convexas con sus superficies convexas frente a la lente del objetivo. Es satisfactorio para su uso con objetivos acromáticos de baja y media potencia. Los oculares de compensación se utilizan con acromático NA alto y los objetivos más corregidos. Debido a que algunas correcciones de lentes se realizan con estos oculares, el ocular debe coincidir con el tipo de objetivo utilizado.

El espacio libre del ojo es la distancia entre el cristalino del ocular y el ojo. Para la mayoría de los oculares, el espacio entre los ojos es de 10 mm o menos, lo cual es inadecuado si la persona que usa el microscopio usa anteojos. Los problemas de visión simples, como la miopía, pueden solucionarse mediante el ajuste fino del enfoque. Los problemas de visión, como el astigmatismo, no se pueden corregir con el microscopio y se deben usar anteojos. Los oculares de punto de mira alto están disponibles para proporcionar el espacio entre los ojos de alrededor de 20 mm necesario para las gafas.

Los oculares normalmente están equipados con varias retículas o retículas para localizar, medir, contar o comparar microestructuras. El ocular amplía la imagen del retículo o retícula y la imagen primaria. Ambas imágenes deben estar enfocadas simultáneamente. También se fabrican oculares especiales para permitir mediciones más precisas que las que se pueden realizar con una escala de retícula. Algunos ejemplos son el ocular de micrómetro de filar o el ocular de micrómetro de tornillo. Dichos dispositivos se pueden automatizar para producir una lectura digital directa de la medición, que tiene una precisión de alrededor de 1 micrómetro.

Normalmente se utiliza un ocular de 10 aumentos, sin embargo, para obtener aumentos estándar, algunos sistemas necesitan otros aumentos, como 6,3 aumentos. Los oculares de mayor aumento, como 1×, 15×, 20× o 25×, también son útiles en determinadas situaciones. El aumento total se obtiene multiplicando el aumento del objetivo, Mo, por el aumento del ocular, Me (Fig. 2). Si también se utiliza un sistema de zoom o fuelle, la ampliación debe modificarse en consecuencia.

Escenario – Se proporciona una platina mecánica para enfocar y mover la muestra, que se coloca en la platina y se asegura mediante clips. La platina de un microscopio invertido tiene placas de platina central reemplazables con orificios de diferentes tamaños. La superficie pulida se coloca contra el orificio para su visualización. Sin embargo, no se puede ver toda la superficie y, con grandes aumentos, no es posible enfocar el objetivo cerca del borde del orificio debido a la distancia de trabajo restringida. En el caso del microscopio vertical, la muestra se coloca en un portaobjetos en la platina. Dado que la superficie pulida debe quedar perpendicular al haz de luz, se coloca arcilla entre el fondo de la muestra y el portaobjetos. Se coloca un trozo de tejido para lentes sobre la superficie pulida y la muestra se presiona contra la arcilla usando una prensa niveladora. Sin embargo, los pedazos de tejido pueden adherirse a la superficie de la muestra. Una alternativa, particularmente útil con muestras montadas, es usar un anillo en lugar de tejido para aplanar la muestra. Las formas anulares de aluminio o acero inoxidable del mismo tamaño que las monturas (ligeramente aplanadas en un tornillo de banco) se asientan sobre la montura en lugar de la muestra.

El microscopio vertical permite ver toda la superficie con cualquier objetivo y el operador puede ver qué sección de la muestra se está viendo. Es una característica útil cuando se examinan áreas específicas en muestras recubiertas, soldaduras y otras muestras donde se van a examinar áreas específicas. Para muestras montadas, un soporte de platina de nivelación automática para monturas puede eliminar la nivelación de muestras en arcilla.

El escenario debe ser rígido para eliminar las vibraciones. El movimiento de la platina, controlado por micrómetros x e y, debe ser suave y preciso y, por lo tanto, normalmente se utilizan engranajes de piñón y cremallera. Muchas etapas tienen escalas para medir las distancias en las direcciones x e y. Los controles de enfoque frecuentemente contienen reglas para estimar el movimiento vertical. Algunas unidades tienen escenarios motorizados y controles de enfoque.

Una platina giratoria circular puede facilitar el examen con luz polarizada. Tales etapas, comunes para estudios mineralógicos o petrográficos, están graduadas para permitir medir el ángulo de rotación. Un escenario rectilíneo normalmente se coloca encima del escenario circular.

De pie – Los microscopios de banco necesitan un soporte rígido, especialmente si se realiza fotomicroscopía en la unidad. Las diversas piezas del microscopio se unen al soporte cuando se ensamblan. En algunos casos, el microscopio de banco se coloca en un soporte separado que también contiene el sistema fotográfico.

Defectos de la lente

Muchos defectos de la lente resultan de las leyes de reflexión y refracción. El índice de refracción de una lente varía con la longitud de onda de la luz, y la distancia focal de la lente varía con el índice de refracción. Por lo tanto, la distancia focal cambia para diferentes colores de luz. Una imagen separada para cada longitud de onda presente se enfoca a diferentes distancias de la lente. Esta es la aberración cromática longitudinal (Fig. 5). Además, la ampliación varía con la distancia focal, alterando el tamaño de la imagen. Esta es la aberración cromática lateral (Fig. 5). Estas diferencias deben eliminarse para producir fotografías en color. Dado que los acromáticos tienen correcciones limitadas para estos problemas, deben usarse con filtrado de luz amarillo-verde para obtener imágenes nítidas. La aberración esférica (Fig. 5) ocurre cuando la luz de un objeto puntual en el eje óptico se refracta con más fuerza en el centro o en la periferia de la lente, lo que produce una serie de posiciones focales en las que la imagen puntual aparece como un círculo de área finita. . Esto se puede minimizar utilizando una apertura que restringe el uso del objetivo a la parte central. El diseño de la lente también puede corregir parte de este problema.

Dado que la superficie de la imagen de enfoque óptimo es curva, se utilizan oculares de compensación con curvatura igual pero opuesta para producir una imagen plana. Otros problemas, como el coma y el astigmatismo, pueden afectar la calidad de la imagen a menos que se corrijan.

Defectos de la lente de la figura 5

Resolución

Para ver detalles microestructurales, se necesita el sistema óptico para producir una resolución adecuada, o poder de resolución, y un contraste de imagen adecuado. Si la resolución es aceptable pero falta el contraste, no se pueden observar los detalles. En general, la capacidad de resolver dos puntos o líneas separados por una distancia 'd' es función de la longitud de onda, 'l', de la luz incidente y de la apertura numérica, NA, del objetivo Esto sigue la ecuación 'd =k.l / NA', donde k es 0.5 o 0.61. La figura 6 muestra esta relación para k =0,61 y cuatro longitudes de onda de luz. También se han informado otras fórmulas. La ecuación no incluye otros factores que influyen en la resolución, como el grado de corrección de los objetivos y la agudeza visual de la persona que mira por el microscopio. Se basa en el trabajo de Abbe en condiciones que no están presentes en la metalografía, como puntos autoluminosos, contraste perfecto en blanco y negro, examen con luz transmitida, una fuente de luz puntual ideal y ausencia de defectos en la lente.

Utilizando la ecuación del párrafo anterior, el límite de resolución para un objetivo con una NA de 1,4 es de alrededor de 0,2 micrómetros. Para ver líneas o puntos separados por 0,2 micrómetros, el aumento requerido debe determinarse dividiendo el poder de resolución del objetivo por el poder de resolución del ojo humano, que es difícil de determinar en condiciones de observación. Abbe utilizó un valor de 0,3 mm a una distancia de 250 mm, que es la distancia del ojo para una visión óptima. Para luz con una longitud de onda media de 0,55 micrómetros, el aumento necesario es 1100 veces la NA del objetivo. Este es el origen de la regla de 1000 NA para el máximo aumento útil. Cualquier aumento por encima de 1000 NA se denomina "vacío" o inútil.

Se debe cuestionar el estricto cumplimiento de la regla de 1000 NA, considerando las condiciones en las que se ha desarrollado, que ciertamente son muy diferentes de las que se encuentran en la metalografía. Según el análisis de Abbe, para una persona que utiliza un microscopio óptico con una visión óptima de 20/20 y para condiciones de contraste óptimas y una longitud de onda de luz media de 550 nm, el aumento más bajo que aprovecha al máximo la NA del objetivo es 550 veces la NA. . Establece un aumento mínimo útil para usar con un objetivo determinado. Se ha sugerido que el límite superior de aumento útil para la persona promedio que usa un microscopio óptico es de 2200 NA, no 1000 NA.

Fig. 6 Relación entre la resolución y la profundidad de campo con apertura numérica

Profundidad de campo

La profundidad de campo es la distancia a lo largo del eje óptico sobre la cual se observan los detalles de la imagen con una claridad aceptable. Los factores que influyen en la resolución también afectan a la profundidad de campo, pero en sentido contrario. Por lo tanto, se debe llegar a un compromiso entre estos dos parámetros, que se vuelven más difíciles a medida que aumenta el aumento. Esta es una de las razones por las que se prefiere el grabado ligero para el examen de gran aumento.

Modos de examen

Para lograr la capacidad de resolución del objetivo seleccionado, el contraste de la imagen debe ser adecuado. El contraste de la imagen depende de la preparación de la muestra y la óptica. Las diferencias en la reflectividad de la luz de la superficie de la muestra producen características de amplitud visibles a simple vista después de la ampliación. Las diferencias de fase creadas por la reflexión de la luz deben hacerse visibles mediante el uso de accesorios de contraste de fase o contraste de interferencia en el microscopio.

Iluminación de campo brillante – La iluminación vertical de campo brillante, el método de observación más utilizado, representa la gran mayoría de las micrografías tomadas. En funcionamiento, la luz pasa a través del objetivo y golpea la superficie de la muestra perpendicularmente. Las características de la superficie normales a la luz incidente reflejan la luz a través del objetivo hacia los oculares, donde las características de la superficie aparecen brillantes. Las superficies oblicuas al haz de luz reflejan menos luz hacia el objetivo y aparecen más oscuras, dependiendo de su ángulo.

Iluminación oblicua – Con algunos microscopios, es posible descentrar el conjunto del condensador o el espejo para que la luz que pasa a través del objetivo incida en la superficie de la muestra en un ángulo no perpendicular. La rugosidad en la superficie de la muestra proyecta sombras, produciendo una apariencia tridimensional. Esto permite determinar las características que están en relieve o están empotradas. Sin embargo, se puede introducir muy poca oblicuidad, ya que esta técnica hace que la iluminación no sea uniforme y reduce la resolución.

En iluminación de campo oscuro – En la iluminación de campo oscuro, se recoge la luz reflejada por las características orientadas oblicuamente y se bloquean los rayos reflejados por las características normales al haz incidente. Por lo tanto, el contraste es esencialmente el opuesto al de la iluminación de campo brillante; es decir, las características que son brillantes en la iluminación de campo brillante aparecen oscuras y las características normalmente oscuras aparecen brillantes. Esto produce un contraste de imagen muy fuerte, con las características oblicuas que aparecen luminosas. Bajo tales condiciones, con frecuencia es posible ver características que no son visibles usando iluminación de campo brillante. Este método es particularmente útil para estudiar estructuras de granos. Sin embargo, la baja intensidad de la luz dificulta la fotomicroscopía, un problema que se reduce con el uso de dispositivos automáticos de control de exposición.

Luz polarizada – La luz polarizada, tal como se utiliza en la metalografía, normalmente se ha limitado a la observación de ciertos metales ópticamente anisotrópicos, como el berilio, el titanio alfa, el zirconio y el uranio, que son difíciles de grabar pero responden bien a la luz polarizada cuando se los pule correctamente. Before development of the electron micro-probe analyzer (EMPA) and energy dispersive spectroscopy (EDS), polarized light examination was an integral part of the method for identifying inclusions. Since the development of these instruments, polarized light has been used less frequently for this purpose, since identification with the EMPA or EDS techniques is more definitive. Most metallurgical microscopes now use synthetic Polaroid filters. The ‘polarizer’ is placed in the light path before the objective, and the ‘analyzer’ is placed in the light path after the objective, normally just below the eyepiece.

Light consists of transverse waves vibrating in all directions at right angles to the direction of propagation. These vibrations occur symmetrically around the direction of propagation and are unpolarized. When light passes through a polarizing filter, the vibrations occur in only one plane in the direction of propagation, and the light is termed plane polarized. This plane changes as the filter is rotated. When the analyzer filter is placed in the light path, plane polarized light passes through it if the plane of vibration of the light is parallel to the plane of vibration of the analyzer. If the plane of vibration of the analyzer is perpendicular to that of the light the light does not pass through, and extinction results. When plane-polarized light is reflected from the surface of an isotropic metal (any metal with a cubic crystallographic structure, such as iron), then passes through the analyzer in the crossed position (plane of vibration perpendicular to that of the plane-polarized light), the image is extinguished, or dark. However, in practice, since the metallurgical microscope does not produce perfectly plane-polarized light, complete extinction does not occur. This is not a serious problem, since polarized light is used only in a qualitative manner in metallography. Strain-free objectives, normally achromats, are to be used. Fluorite or apochromatic objectives are unsuitable. A strong white-light source is needed to produce accurate colour effects.

If an optically anisotropic, polished metal is placed under the light beam with the polarizer and analyzer crossed, the microstructure is revealed. The quality of sample preparation is very important, and the surface is to be perpendicular to the light path. Rotation of the sample under the beam changes light intensity and colour. Since it is difficult to set the polarizer and analyzer in the crossed position accurately when an anisotropic sample is in place unless the crossed positions are marked on the polarizer and the analyzer, it is best to find this position first using an isotropic sample.

When plane-polarized light strikes an anisotropic metal surface, reflection occurs as two plane-polarized components at right angles to each other. The directions vary with crystal structure. The strength of these two perpendicular reflections can change, and a phase difference exists between them. These differences vary with each metal and depend on the crystal orientation. No reflection is obtained when the basal plane of hexagonal or tetragonal crystals is perpendicular to the light beam. Maximum reflectance occurs when the principal symmetry axis of the crystal is perpendicular to the light beam. The resultant image is predominantly influenced by these orientation effects with phase differences are of little significance.

When the analyzer is crossed with respect to the polarizer, rotation of plane-polarized light from the anisotropic surface allows the light to pass through the analyzer, producing an image in which each grain has a different light intensity and colour, depending on its crystal orientation relative to the light beam. As the stage is rotated, each grain changes four times in intensity from light to dark during a 360 degree rotation. If the phase difference is appreciable, the light is elliptically polarized, the difference in intensity in each grain with rotation is less, and extinction is not observed. Colour images are obtained when the reflected plane-polarized light varies with wavelength. When little colour is present, a sensitive tint plate inserted between the polarizer and the objective enhance colouration.

Isotropic metals can be examined using crossed-polarized light if the surface can be rendered optically active by etching, staining, or anodizing. Procedures have been developed for several metals, however, all etched surfaces do not respond to polarized light. Normally, the etch s to produce etch pits or facets in each grain to cause double reflection at these features. Grains with different crystal orientations produce differently oriented pits or facets, yielding different degrees of elliptical polarization and hence varying light intensity. Anodizing produces a thick oxide film on the sample surface and irregularities in the film lead to double reflection.

Although the polarization response of anodized samples has been attributed to optical anisotropy of the film, experimentation has shown that the effect is due to film surface irregularities. Tint etchants produce surface films which result in interference colours which can be enhanced using polarized light. In general, best results are achieved when the analyzer is shifted slightly from the crossed position. In addition to its use in examining inclusions, anisotropic metals (antimony, beryllium, bismuth, cadmium, cobalt, magnesium, scandium, tellurium, tin, titanium, uranium, zinc, and zirconium, for example), and etched / anodized/ tint-etched cubic metals, polarized light is useful for examination of coated or deformed metals. Phase identification can also be aided in some cases. The internal structure of graphite nodules in cast iron is vividly revealed using polarized light. Martensitic structures are frequently better revealed using polarized light, which illustrate lath martensite in a high-strength iron-base alloy.

Phase contrast illumination – It permits examination of subtle phase variations in microstructures with little or no amplitude contrast from differences in the optical path at the surface (reflected light) or from differences in the optical path through the sample (transmitted light). Differences of height as small as 0.005 micrometers can be detected. Application of phase-contrast illumination in metallography has been limited. The technique needs a separate set of objectives and a special vertical illuminator.

Interference-contrast illumination – Differential interference-contrast illumination produces images with emphasized topographic detail similar to those observed using oblique illumination. Detail which is invisible or faintly visible using bright-field illumination can be revealed vividly with interference-contrast illumination. Examples of the topographic detail which can be revealed using differential interference-contrast illumination are the relative hardness of the constituents or the nature of the etching process, that is, which areas or constituents are attacked by the etchant. In some cases, other aspects of the structure can be revealed which are invisible or faintly visible in bright-field illumination.

Interference techniques – Several interference techniques are used to measure height differences on samples. Interference fringes on a perfectly flat surface appear as straight, parallel lines of equal width and spacing. Height variations cause these fringes to appear curved or jagged, depending on the unit used. The interference microscope divides the light from a single point source into two or more waves which are superimposed after traveling different paths. This produces interference. Two-beam and multiple-beam instruments are the two basic types of interferometers used. The measurements are based on the wavelength of the light used. Two-beam interferometers can measure height differences as small as ‘l’/20; multiple-beam interferometers, as small as ‘l’/200.

The Linnik-type interferometer is a two-beam reflecting microscope which uses non-polarized light. A beam-splitting prism produces two light beams from a monochromatic light source. One beam travels through the test piece objective to the test piece surface and is reflected back through the objective to the eyepiece. The other beam travels through the reference objective, strikes an optically flat reference mirror, and returns to the beam splitter, then to the eyepiece. If the path difference between the two beams is not equal or not a multiple of ‘l’/2, interference occurs and contour lines are formed which indicate locations of equal elevation. The height difference between adjacent fringes is ‘l’/2.

The Tolansky multiple-beam interferometer produces interference between many light beams by placing a reference mirror which is partially transmitting and partially reflecting very near the sample surface but slightly out of parallel. The reference mirror has a known reflectivity selected to approximate that of the surface. Light passes through the reference mirror and strikes the sample surface, is reflected by the sample surface, and interferes with the rays reflected between the reference mirror and the sample. The fringes produced by the multiple-beam interferometer are sharper than those from the two-beam interferometer, which accounts for the greater accuracy. The distance between the fringes is also ’l’/2. Elevations produce displacements of the fringes from parallel alignment. The displacement is compared to the distance between the fringes to obtain height measurements.

Light-section microscopy – The light-section microscope, also used to measure surface topography, complements interference techniques. Roughness differences from 1 micrometer to 400 micrometers can be measured, which is useful in examining machined surfaces and for measurement of surface layers or films. In operation, a slit is placed near the field iris in the illumination system and is imaged by an objective as a light line on the surface to be measured. Oblique illumination is used with a dark background. The light band is observed using a second objective which is identical to the first. The objectives are 45 degrees to the sample surface and 90 degrees to each other. A reticle in the eyepiece is used for measurements, or they are made on photographs. Vertical resolution is not as good as with interferometers, but lateral resolution is better.

Auxiliary techniques

Several special devices can be used with the optical microscope to get additional information. These techniques are described below.

Micro-hardness testing – Micro-indentation hardness data can be obtained by adding indenter attachments to the microscope. Single-purpose units also are made by many manufacturers of hardness test equipment. Loads are normally made from 1 g (gram) to 1,000 g, although some manufacturers have units for low loads (0.05 g to 200 g). Knoop or Vickers indenters can be used.

Hot-stage microscopy – Hot-stage microscope cells are available from several manufacturers. Single-purpose units can also be used. Cold-cell attachments have also been produced, but have rather limited use in metallography. The hot-stage microscope has been used to study phase transformations on heating or cooling or at constant temperature. Examination of reactions in the hot-stage microscope cell needs use of long-working-distance objectives, since the sample is held within the cell. Moreover, since the cell window is quartz, the objectives is to be quartz-corrected, especially those with magnifications of 20× or more.

Techniques other than chemical etching are to be used to view phase changes. Grain boundaries are to be thermally etched if the sample is held at a constant temperature in the vacuum. Grain-boundary grooving is easily observed using bright field illumination. Phase transformations are visible by the relief produced at the surface. Hence, shear reactions, such as those produced by martensite or bainite formation, are most easily observed. Other phase transformations are more difficult or impossible to observe. Transformations can be photographed in situ, for which motion picture cameras are normally used.

Special stages – These are available in a variety of configurations. Auto leveling stages for mounted samples are a typical example. Universal tilting stages have also been made for rapid manipulation of rough, irregular samples. Special stages have also been designed for handling small objects. A number of stages have been made for performing in situ experiments. Basic studies of solidification have been performed by in situ observation of the freezing of low-melting-point organic materials, such as camphene, which solidify like metals. Observation of the recrystallization of low-melting-point metals and alloys has been similarly observed. Special stages have been used to observe the progress of electrolytic polishing and etching. Cells have also been used for in situ examination of corrosion processes. Stages have been designed to observe a variety of processes involving static or dynamic stress, and devices have also been designed to permit physical extraction of inclusions.

Hot-cell microscopy – Metallographic preparation of radioactive materials needs remote-control preparation using specially designed hot cells. Special microscopes have been designed for use with the hot cell.

Field microscopy – When the microstructure of a component or large object which cannot be cut and moved to the laboratory is to be examined, portable laboratory equipment, made by several manufacturers, can be used to polish a section in situ. A portable microscope can be sometimes used to examine and photograph the microstructure. If this cannot be done, replicas can be made and examined using an optical microscope or an electron microscope.

Comparison microscopes – The need occasionally arises to compare two microstructures. Normally, this is carried out by placing micrographs from each sample side-by-side, but it can also be performed using special microscopes. A bridge comparator is used to combine images from two bench microscopes for simultaneous viewing.

Television monitors – Projection microscopes can be used for group viewing, but it is more common to display the microstructure on a black-and-white or colour monitor. A number of high-resolution closed-circuit systems are available.

Clean-room microscopy – The study of small particles is influenced by dust contamination during viewing. Hence, such work is to be performed in a clean box, clean bench, or clean room which is specially made to provide a dust free environment.

Image analyzers – The increased use of quantitative metallography, particularly for characterization of inclusions, has promoted development of automated image analysis systems based on television principles. Phases or constituents of interest are detected primarily by differences in light reflectivity which produce gray-level differences on the monitor. Majority of the stereological measurements can be made using these systems. Considerable automation has been achieved using automated stages and powerful minicomputers. Although these devices can be quite expensive, they have stimulated interest in stereology and its application to structure-property correlations.

Features are detected on as-polished or etched samples, depending on the nature of the feature of interest. If etching is needed, selective techniques are normally used. Field and feature-specific measurements are utilized. Field measurements measure all the detected features simultaneously, as in volume fraction measurements. In feature-specific measurements, each separate particle is measured sequentially. This procedure is normally used for shape and size measurements.

Some structures do not lend themselves to accurate measurements using such systems. For example, quantification of fracture surface detail cannot be performed using an automatic image analyzer, since the device cannot separate fracture features by gray level. Many transmission electron micrograph structures also cannot be analyzed using these devices. For such structures, semi-automatic tracing devices can be used with the operator performing detection with a light pen or stylus. These lower-cost systems can be used for nearly any stereological measurement. Because of the greater time needed for detection, they are less suitable for measurement problems which need sampling of many fields.

Photo-microscopy

Prior to the development of photographic attachments, microstructures were to be sketched. Although the need for such documentation is no more there, sketching remains useful as a teaching method. Photo-microscopy is important in metallography, since the photo-micrograph can faithfully reproduce the detail observed for others to view. With the equipment presently available, high-quality micrographs are easily produced. However, this needs careful attention to sample preparation, etching, and use of the microscope. Reproduction of false microstructures is all too common and has caused inaccurate interpretations, rejection of good materials, and faulty conclusions in failure analyses.

Historically, darkroom photographic procedures have been most prevalent. Since the introduction of instant photographic processes such as Polaroid, however, many photo-micrographs have been made using these materials, taking advantage of their speed and efficiency. However, image reproduction is sacrificed, and the process is to be repeated for each extra copy. Use of an automatic exposure device is necessary with instant process film to minimize waste. Traditional darkroom photographic methods need more effort, but yield better micrographs. Considerable automation in wet darkroom processes is possible, but frequent use of photo-microscopy is needed to justify the cost of such equipment.

Obtaining good micrographs needs adequate image contrast and resolution, uniform focus over the entire field, uniform lighting, and adequate depth of field. The light source is to be properly aligned, and the system is to be free of vibration. The yellow-green filter is to be employed to correct lens defects. The optics is to be clean, and the field and aperture diaphragms are to be adjusted correctly. The microscope is focused in a variety of ways, depending on the model. Several film formats can be used, such as plates, sheet film of different size, or 35-mm roll film. The magnification at the film plane is to be known. This is a simple procedure if the only variables are the objective and eyepiece magnification, but is more difficult when using a zoom system or bellows. A stage micrometer can be utilized to determine the true magnification.

A range of black-and-white and colour films is available for darkroom or instant techniques. The manufacturers of these films document film characteristics. Black-and-white films are normally used due to their lower cost. They show better contrast control, are easier to process, and are normally quicker to use than colour films. Colour film has some important uses for which its cost is justified. In traditional black-and-white photography, a negative image is produced first and is used to produce a positive image of the microstructure on suitable paper. The micrograph lasts for many years without any apparent change. Selection of the negative film is based on the format available, colour sensitivity, contrast, resolving power, speed, graininess, and exposure and development latitudes.

Some black-and-white films are not sensitive to the entire visible spectrum. Orthochromatic films are sensitive to all colours except orange and red. Panchromatic films are sensitive to all colours, although they emphasize blue and de-emphasize yellow. A yellow filter can be used to reduce this colour bias.

Orthochromatic films can be developed under dark red light, but panchromatic films need total darkness. Orthochromatic films are very good for photo-microscopy, particularly when a yellow-green filter is inserted to correct lens defects.

Film speed is a critical variable only when illumination is low, as in polarized light, interference-contrast, or dark-field illumination. Orthochromatic film has a medium contrast which is adequate for most structures. Contrast can be enhanced with a high-contrast film. The resolving power of a film defines its ability to record fine details in the image. Hence, a high-resolving-power film is desirable. Graininess depends on the size of the silver grains in the emulsion, the developer used, and the development time and temperature. High-speed films are grainier than low-speed films, making them less suitable for enlarging. Contact printing is preferred. It needs a large film size, but saves enlargement time. It produces better images and eliminates re-determining the magnification of the print. A fine-grain film provides the best resolution.

When a negative is exposed, there is an allowable range of exposures which produces a useful, printable negative. Wide exposure latitude is quite valuable. Each film includes information on its characteristic relationship between exposure time and density. The exposure selected is to be on the linear portion of the density-time curve. A good, dense negative allows suppression of some of the fine image defects during printing. An underexposed negative greatly restricts printing and normally results in a poor print. Development of negatives is rather simple and involves use of a developing solution, a stop bath, a fixing solution, as well as washing and drying.

The correct exposure is most easily determined using a built-in exposure meter. If this is not available, a test exposure series can be made. This is accomplished by pulling out the film slide completely and exposing the entire film for a time judged to be considerably shorter than that needed. The slide is then inserted so that it covers around 10 mm to 20 mm of the film, and the exposure is repeated. This is repeated incrementally until the slide is fully inserted, covering the film. After development, the correct time can be assessed based on the density of the negative in each band.

Alternatively, the step exposure can be performed using an instant film of the same speed, saving the darkroom time. Majority of the black-and-white films are contact printed. The negative is placed emulsion side up on the contact printer, and a suitable paper is placed emulsion side down over the negative. The printer is closed, and light is passed through the film onto the paper. The print is developed, stopped, fixed, washed, and dried. Print contrast is controlled by the type of paper and development time. Print contrast types vary from extra-soft (flat) to extra-contrast (grades 1 to 5). Number 3 paper is used most frequently. Number 4 paper is used to increase contrast, and No. 2 paper to reduce contrast.

Instant process films eliminate the darkroom work, thus hastening the process. Polaroid prints use the diffusion-transfer reversal process. Development begins when the film is removed from the camera after the exposure. The action of pulling the film out of the camera crushes a pod containing the viscous, caustic developer and spreads it over the film. Black-and-white films develop rapidly while the colour prints need slightly more time. Some of the Polaroid films have very high speeds, an advantage in dim lighting. Some prints are to be coated with a neutralizing stabilizer / protective varnish to prevent staining and fading. Also available are instant films which produce a negative and a positive print. This negative is to be cleared, but a darkroom is not required. Polaroid films used in microscopy are all panchromatic. They are available as roll film, film packs, or sheets. Exposure times are to be more accurately controlled to get good prints than with traditional wet-process films.

Macro-photography

Examination and photography are frequently needed for such objects as macro-etched disks and broken parts. Examination can be performed visually or with the aid of a simple hand lens or stereo-microscope. Macro-photography can be performed using majority of the cameras, perhaps aided by the use of close-up lens attachments, a bellows, or a macro-lens. Many stereomicroscopes can be equipped with cameras for photography while some takes stereo-pairs. A few manufacturers offer camera stands for macro-photography. Some metallographs also have low-magnification objectives which can perform certain types of macro-photography.

Macro-photography utilizes magnifications from less than 1× to 50×. Most laboratories, especially those engaged in failure analyses, have various cameras, light sources, and stereo-viewers to cover the wide range of objects photographed. Correct lighting is necessary to emphasize details and provide even illumination without glare or reflection. Adjustment of lighting needs some experimentation and experience. Available lighting includes flood lamps, rings, coaxial, or fiber optics. A light box is useful for eliminating shadows, but considerable creativity is needed to achieve good results.

Depth of field and resolution are important variables. Many of the objects to be photographed are three-dimensional, which needs a certain depth of field and proper lighting to reveal shape and texture. Depth of field varies with the aperture diaphragm lens setting, the magnification, and the focal length of the lens. Stopping down the aperture improves depth of field, but decreases image brightness and clarity. Depth of field also increases as magnification decreases and focal length increases. For magnifications below 5×, focal lengths of 100 mm or more are preferred. Shorter-focal-length lenses are used for higher magnifications.