Las nanopartículas de oxohidróxido de cobre dopado con ligando son antimicrobianos eficaces

Métodos

A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron utilizando agua de ultra alta pureza (UHP) (purificación por ósmosis inversa; 18,2 ΩM / cm), a temperatura ambiente (20 ± 2 ° C), y todos los reactivos se compraron a Sigma Aldrich.

Formulaciones de cobre y nanopartículas CHAT

Se prepararon reservas de cloruro de cobre (cobre 40 mM) disolviendo CuCl ₂ · 2H ₂ O en agua. Se prepararon reservas de nanopartículas de óxido de cobre (CuO NP; Sigma 544868) a partir de un polvo comercial que estaba libre de impurezas, tenía un tamaño de partícula primaria de 34 nm (rango de 10 a 50 nm) y se probó previamente como agente antimicrobiano [24, 25,26]. Estas reservas se prepararon a 1,3 g / L de cobre dispersando el polvo en agua con agitación vigorosa. Se sintetizaron suspensiones coloidales de nanopartículas CHAT utilizando un método de coprecipitación [27]. Brevemente, se disolvieron cloruro de cobre, ácido tartárico y ácido adípico en agua para lograr una relación molar de cobre / ácido tartárico / ácido adípico en la suspensión final de 2:1:1 y una concentración de cobre de 2,5 g / L. El pH inicial de la mezcla siempre estuvo por debajo de 2,5 y el cobre se solubilizó por completo. A continuación, se aumentó lentamente el pH mediante la adición gota a gota de una solución concentrada de NaOH (5 M) con agitación constante hasta un pH de 8,2 ± 0,2.

Distribución de fase y contenido de cobre de las suspensiones de CHAT

El contenido de cobre en suspensiones coloidales se determinó mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplada inductivamente (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Todas las muestras se diluyeron hasta concentraciones inferiores a 100 mg / L en HNO al 5% ₃ ( v / v ) al menos 24 h antes del análisis para garantizar la total solubilidad del cobre. Los estándares de calibración (0,1 a 100 mg / L de cobre) se emparejaron con la matriz en HNO al 5% ₃ y la cuantificación del cobre se llevó a cabo a 324,754 nm. El fraccionamiento del cobre en porcentajes de cobre aglomerado, nanoparticulado y soluble se logró mediante filtración y ultrafiltración de soluciones madre de CHAT. Las suspensiones se filtraron (límite de 200 nm) y el retenido se consideró como la fracción aglomerada. Para aislar el cobre soluble y distinguirlo del cobre nanoparticulado, la suspensión coloidal se ultrafiltró a través de un filtro de 3 KDa (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000 × g , 5 min) ya que esto corresponde a un corte por debajo de 1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). El contenido de cobre de todas las fracciones (total, filtrado de 200 nm, ultrafiltrado de 3 KDa) se determinó mediante ICP-OES, y las fracciones expresadas como porcentaje en relación con el contenido total de cobre son las siguientes:

Determinación del contenido de cobre y las proporciones de cobre a ligando en nanopartículas de CHAT secas

Las nanopartículas de CHAT se aglomeraron y precipitaron para permitir la recuperación y eliminación de los componentes no unidos. Para permitir esto, se añadió etanol a suspensiones coloidales de CHAT (2,5 g / L de cobre) en una proporción de etanol / suspensión 2:1 ( v / v ), y los aglomerados de CHAT resultantes se recuperaron mediante centrifugación (4500 × g × 15 min en un Mistral 6000). Se descartó la fase de solución, que contenía especies de ligando no unidas. La determinación del contenido de cobre en CHAT en fase sólida fue la siguiente. Se produjo un polvo secando en horno el sedimento precipitado etanólico hasta peso constante a 45 ° C. A continuación, se molió y se molieron 35,2 ± 0,3 mg ( n =2) se digirió en 11 ± 1 g de HNO al 70% ₃ , con pesos precisos registrados. Una vez digerida por completo, esta solución se diluyó 20 veces en agua y se determinó la concentración de cobre mediante ICP-OES. Las proporciones de ligando a cobre se determinaron directamente a partir de aglomerados de CHAT precipitados con etanol, secos. Los aglomerados se resuspendieron primero en agua hasta su volumen original para facilitar la disolución con cantidades más bajas de HCl, un requisito para el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se disolvieron alícuotas en HNO ₃ al 5% para análisis ICP-OES de cobre (como se describió anteriormente) o en HCl 80 mM para análisis HPLC de ligandos (ácidos tartárico y adípico). El análisis de ligandos se llevó a cabo en un sistema de cromatografía de fase inversa estándar (columna C18 en un Waters Alliance 2690/5 equipado con un detector PDA 2998; se dan más detalles en el archivo adicional 1).

Caracterización fisicoquímica de suspensiones CHAT

La distribución del tamaño de partícula hidrodinámica se determinó mediante dispersión de luz dinámica (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Se transfirieron alícuotas de suspensiones coloidales CHAT (2,5 g / L de cobre) a una cubeta desechable de 1 ml y se midieron ( n =3) se llevaron a cabo a 25 ± 2 ° C. Nuevamente, la configuración exacta se muestra en el archivo adicional 2. El potencial zeta de las suspensiones CHAT se determinó mediante microelectroforesis láser Doppler (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) utilizando células capilares plegadas desechables (DTS1070) y asumiendo una constante dieléctrica de 78,5 y una viscosidad de 0,89 cP. La caracterización por microscopía electrónica de transmisión (TEM) se llevó a cabo aplicando una gota de suspensión de CHAT a rejillas perforadas de carbón perforado y secando a 50 ° C durante la noche. Luego se tomaron imágenes de las cuadrículas en el TEM (FEI-Philips CM100) a 120 kV en modo de campo claro.

Actividad antimicrobiana de las formulaciones de cobre

Los ensayos se llevaron a cabo en medio MOPS de metales pesados ​​(HMM), un medio reconocido compatible con iones metálicos (archivo adicional 3), que se complementó con glucosa al 0,4% y hidrolizado de ácido de caseína al 0,1%, y el pH se ajustó a 7,2 ± 0,2 [28] . Antes de la adición de compuestos de cobre, Escherichia coli (NCTC11100) y Staphylococcus aureus Se cultivaron RN4220 [29] durante la noche a 30 ° C con agitación constante en una incubadora Infors HT Minitron a 80 rpm. Posteriormente, las suspensiones bacterianas se diluyeron a una densidad óptica de 0.05-0.1 (ca. 10 ⁶ células / ml) a 595 nm para E. coli ( Multiskan RC 351 Labsystem) o 600 nm para S. aureus (Lector de placas Multiskan, ThermoFisher Scientific). A continuación, se diluyeron reservas de cloruro de cobre y CHAT coloidal en HMM y se agregaron a las suspensiones bacterianas para obtener concentraciones finales de cobre entre 0,4 y 100 mg / L. Luego, la incubación tuvo lugar durante un período de 6 a 9 h, y el crecimiento bacteriano se determinó controlando la densidad óptica como una medida de la biomasa bacteriana.

La solubilidad del cobre a lo largo del tiempo en el medio de crecimiento bacteriano se determinó diluyendo las reservas de cloruro de cobre y CHAT coloidal en HMM a 12,5, 25 y 50 mg / L de cobre y determinando la fracción de cobre soluble a las 0, 2, 4 y 8 h mediante ultrafiltración. (3 KDa) y análisis ICP-OES, como se describe anteriormente.

Biodisponibilidad intracelular de formulaciones de cobre

Bacterias sensoras de Cu bioluminiscentes recombinantes, E. coli MC1061 (pSLcueR / pDNPcopAlux), que responden a cantidades sub-tóxicas de cobre biodisponible aumentando su bioluminiscencia, se utilizaron para cuantificar la biodisponibilidad de los compuestos de cobre [30]. Se prepararon suspensiones bacterianas como se describe para el ensayo de actividad antimicrobiana y se incubaron con una serie de diluciones de cloruro de cobre y CHAT (0 a 50 mg / L de cobre) en microplacas de 96 pocillos durante 4 h. La bioluminiscencia se midió con un luminómetro de placa Orion II (Berthold Detection Systems) y la inducción de bioluminiscencia se calculó de la siguiente manera:

Estrés intracelular inducido por formulaciones de cobre

Se evaluó la capacidad de los compuestos de cobre para inducir aniones superóxido intracelulares y roturas de ADN de una sola hebra con bacterias bioluminiscentes recombinantes, E. coli K12 ::soxRSsodAlux y E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivamente [17]. Se prepararon cultivos bacterianos como se describe para el ensayo antimicrobiano y las bacterias se expusieron a una serie de diluciones de cloruro de cobre y CHAT (0 a 50 mg / L de cobre) en microplacas blancas de 96 pocillos durante 4 h. El rendimiento de los biosensores se controló exponiendo las bacterias a la menadiona química inductora del anión superóxido (0,04 a 30 μg / L), o al peróxido de hidrógeno (0,1 a 150 mg / L), como controles positivos para E. coli K12 ::soxRSsodAlux o E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivamente. De nuevo, las bacterias se incubaron en microplacas blancas de 96 pocillos y se midió la bioluminiscencia con un luminómetro de placa Orion II y se calculó la inducción de bioluminiscencia como en la Eq. 5.

Incorporación de formulaciones de cobre en geles de hidroxietilcelulosa

Las reservas de cloruro de cobre, CHAT y nanopartículas comerciales de óxido de cobre sin modificar (CuO NP) se diluyeron en agua UHP a 250 mg / L de cobre. Las suspensiones resultantes de CHAT y CuO NP tenían un pH casi neutro y podían incorporarse directamente en el gel, pero la solución de cloruro de cobre seguía siendo ácida después de la dilución y, por lo tanto, se ajustó a pH 7,0 ± 0,2. Luego se disolvió hidroxietilcelulosa (HEC) directamente (2% w / v ) en las diversas soluciones madre diluidas usando un mezclador de rodillo (Denley Spiramix 5) hasta que se formaron geles homogéneos. Se transfirieron diez gramos de cada gel a tubos Falcon y se dejaron reposar durante la noche. A continuación, 10 ml de tampón de bicarbonato de sodio 50 mM recién preparado (disuelto en NaHCO ₃ polvo y ajustado a pH 7,0 ± 0,2) se transfirió a cada tubo con cuidado para minimizar las alteraciones en la interfaz gel-líquido (área de superficie específica de 7,1 cm ² ). Luego, las alícuotas fueron recolectadas y analizadas por ICP-OES para determinar la liberación de cobre a lo largo del tiempo.

Resultados

Como se describe en la sección “Métodos”, CHAT se sintetizó de manera similar a su análogo de hierro, IHAT [21, 22], dopando oxohidróxido de cobre (2,5 g / L de cobre) con ácidos tartárico y adípico. Esto produjo suspensiones coloidales estables en las que todo el cobre pasó por un filtro de 200 nm pero muy poco (5%) pasó por un filtro de 3 KDa. Esto indicó que la mayor parte del cobre era nanoparticulado (95%; Fig. 1a) con poco cobre "libre" y sin grandes aglomerados detectables, de nuevo como el análogo IHAT [21, 22]. Cuando se precipitó en etanol, para eliminar las especies de ligandos no unidos y luego se secó, el CHAT contenía 31 ± 1% de cobre ( w / w ) por análisis ICP-OES. Las relaciones molares de cobre a ligando, este último determinado por HPLC, fueron 2:1 para cobre a tartrato y 2:0,3 para cobre a adipar. Las partículas de CHAT parecían casi monodispersas con diámetros de 2-3 nm por imágenes de TEM (Fig. 1b). Estos hallazgos fueron consistentes con los datos de tamaño hidrodinámico para CHAT más un caparazón de hidratación, ya que el diámetro medio por volumen en agua UHP fue de 3.4 nm (Fig.1c) y la distribución de tamaño fue estrecha (2.4-5.6 nm para el 80% del volumen) cuando evaluado con dispersión de luz dinámica. El potencial zeta promedio fue -39 mV (Fig. 1d), consistente con las nanopartículas que forman una dispersión acuática estable [27] y, de hecho, la suspensión de stock de CHAT demostró ser estable durante varios años (Archivo adicional 4).

Caracterización de la solución madre de CHAT. un Distribución de la fase de cobre a 2,5 g / L CHAT:porcentaje soluble (<3 KDa) y nanoparticulado. b Imágenes de dispersión de nanopartículas por TEM. c Distribución hidrodinámica del tamaño de partículas de partículas recién preparadas, determinada por la dispersión dinámica de la luz. d Distribución del potencial zeta ( n =3; las barras de error representan desviaciones estándar)

A continuación, consideramos la actividad antimicrobiana de CHAT cuando las suspensiones madre se diluyeron en un medio de crecimiento bacteriano a concentraciones asociadas con la actividad antimicrobiana de las sales de cobre. Para CHAT y cloruro de cobre, la curva de inhibición del crecimiento fue muy similar tanto para E. coli y S. aureus la mayor parte de la actividad ocurre a concentraciones de cobre total entre el rango de 12.5 y 50 mg / L (Fig. 2). Completa E. coli Se observó inhibición del crecimiento tras la incubación con 18,8 (CuCl ₂ ) y 25 (CHAT) mg / L de cobre, mientras que para S. aureus , se obtuvo una inhibición total del crecimiento a 75ºC (CuCl ₂ ) y 100 (CHAT) mg / L de cobre (Fig. 2; El porcentaje de inhibición del crecimiento frente a la concentración de cobre se proporciona en el archivo adicional 5).

Escherichia coli (arriba) y Staphylococcus aureus (abajo) curvas de crecimiento, representadas aquí como densidad óptica, tras la exposición a diferentes concentraciones de cloruro de cobre (izquierda) o CHAT (derecha) en HMM complementado.

De hecho, a estas concentraciones de antimicrobianos, al menos el 94% de CHAT se solubilizó rápidamente (en 15 min), de nuevo a juzgar por la ultrafiltración y el análisis ICP-OES (Fig. 3a). Por lo tanto, anticipamos que la eficacia antimicrobiana de CHAT estaba relacionada con esta labilidad química, con una rápida disolución de las nanopartículas que permitían la adquisición bacteriana intracelular de iones de cobre. Para probar esto, desafiamos a la E. coli , MC1061 (pSLcueR / pDNPcopAlux), en el que la bioluminiscencia aumenta en respuesta a concentraciones sub-tóxicas de iones de cobre intracelulares [30], con 0 a 50 mg / L de cobre como CHAT o cloruro de cobre. El aumento de las concentraciones en el medio de cultivo de ambas fuentes de cobre condujo a un aumento de la bioluminiscencia en E. coli deformación del sensor de cobre (Fig. 3b), consistente con aumentos en el cobre intracelular. La pendiente de la curva dosis-respuesta fue idéntica hasta 6,25 mg / L para ambas fuentes de cobre, lo que confirma que el cobre biodisponible de CHAT era comparable a una fuente completamente solubilizada. Posteriormente, a concentraciones de hasta 50 mg / L de cobre, la luminiscencia no aumentó debido a la toxicidad de ambos compuestos de cobre (Fig. 3b).

un Perfil de disolución de CHAT en HMM suplementado a 12,5, 25 y 50 mg / L de cobre. Dosis-respuesta de la inducción de bioluminiscencia de bacterias luminiscentes recombinantes: b E. coli MC1061 Bacterias pSLcueR / pDNPcopAlux, c E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) y d E. coli K12 ::soxRSsodAlux tras la exposición durante 4 h en HMM suplementado a cloruro de cobre, CHAT (concentración en mg Cu / L) y controles respectivos (menadiona en c y H ₂ O ₂ en d )

Paralelamente al estudio del cobre intracelular en E. coli expuestos a soluciones preparadas con CHAT o cloruro de cobre, también probamos la capacidad de estas soluciones para activar aniones superóxido intracelulares o para causar daño al ADN bacteriano en diferentes E. coli biosensores basados ​​en En ninguno de los casos hubo un efecto significativamente observable, a pesar de que los sensores respondieron a controles positivos relevantes, a saber, peróxido de hidrógeno y menadiona, respectivamente (Fig. 3c, d). En conjunto, las respuestas equivalentes de los tres biosensores bacterianos a soluciones preparadas a partir de diferentes formas químicas de cobre respaldan firmemente la idea de que, en ambos casos, las bacterias estaban expuestas al mismo cobre soluble, a pesar de que una formulación comenzaba como nanopartículas.

Finalmente, como se señaló anteriormente, la ventaja de CHAT sobre las sales de cobre solubles solo sería aparente si una formulación concentrada permitiera que la primera conservara su labilidad química a diferencia de la última. Utilizando hidroxietilcelulosa (HEC), una base acuosa común para formulaciones tópicas [31,32,33], incorporamos 250 mg / L de cobre como cloruro de cobre, CHAT o como NP de CuO comerciales. Cuando 10 ml de NaHCO 50 mM ₃ tampón, como un exudado simplificado de la herida, se añadieron a 10 g de cada uno de los geles de HEC con cobre incorporado (es decir, 2,5 mg de cobre), hubo una liberación sostenida de cobre de la preparación que contiene CHAT, a más de 60 mg / L por 24 h (figura 4). Además, la liberación fue relativamente rápida y las concentraciones de actividad antimicrobiana se alcanzaron a las 2-4 h. Por el contrario, el cloruro de cobre con pH neutralizado era un sustrato pobre para la liberación de cobre, como se anticipó por su tendencia a hidrolizarse y formar aglomerados de oxohidróxidos de cobre, por lo que a las 24 h, solo se habían logrado 10 ± 7 mg / L de cobre en solución. (Figura 4). Los NP de CuO comerciales no produjeron ninguna liberación de cobre perceptible (Fig. 4).

Liberación de cobre de las matrices HEC que contienen CHAT, cloruro de cobre u nanopartículas de óxido de cobre (CuO NP), todas a 250 mg / L de cobre

Discusión

Mostramos aquí que un nanomaterial a base de cobre, llamado CHAT, puede formularse a altas concentraciones, a diferencia de las nanopartículas de cobre descritas anteriormente [34, 35], conservando sus propiedades como fuente lábil de cobre biodisponible con eficacia antimicrobiana. Como se señaló anteriormente, la síntesis de CHAT se inspiró tras muchos años de trabajo anterior sobre el análogo del hierro, IHAT [21, 22]. Esto, a su vez, se inspiró en la solución de la naturaleza para el rápido recambio mineral in vivo, para el reciclaje eficiente de iones metálicos esenciales, mediante el cual se utilizan moléculas orgánicas para desestabilizar la estructura cristalina de las partículas minerales primarias [21, 22]. En las versiones sintéticas, los ligandos GRAS se incorporan en oxohidróxidos metálicos a medida que se forman en solución a partir de polímeros reticulantes [21, 22]. A través de la desestabilización estructural, esto asegura la labilidad de la fase mineral final y también genera nanopartículas altamente negativas, como lo demuestra la medición del potencial zeta, que repelen la aglomeración y agregación, produciendo suspensiones de nanopartículas que se mantuvieron estables durante años. Aquí, y como se mostró anteriormente para IHAT, el tartrato fue el ligando dominante para lograr estos cambios fisicoquímicos en la estructura del oxohidróxido de cobre desde que su incorporación fue de aprox. 3 veces mayor que el del adipato; este último se comporta más como un amortiguador durante la síntesis [21, 22].

En ausencia de modificación, los oxohidróxidos metálicos recién precipitados se aglomerarán y agregarán y comenzarán a envejecer, por lo que se condensan y aumentan gradualmente su cristalinidad. Estas transiciones de tamaño y fase mineral reducen la capacidad de las estructuras para participar en la reacción inversa, es decir, para volver a disolverse. Por lo tanto, no fue sorprendente que cuando el oxohidróxido de cobre se formó recientemente, a partir de la neutralización del pH de una solución de cloruro de cobre, se liberó al menos algo de cobre soluble en nuestro ensayo de liberación de gel (Fig.4), mientras que para los NP de CuO comerciales, que fueron aglomerado y compuesto por una fase mineral más condensada (es decir, óxido de cobre), se liberó cobre indetectable. La falta de disolución de las nanopartículas comerciales de 30 nm, que, independientemente de su estado de agregación, habrían presentado una gran superficie de disolución, muestra que la fase mineral es un factor clave en la liberación de iones de cobre y que, como se señaló anteriormente, la modificación de las partículas primarias del mineral, logradas aquí mediante el dopaje de ligandos, es realmente necesario para provocar un cambio marcado en las características de disolución. Además, la síntesis de CHAT se llevó a cabo a temperatura ambiente, ya que la alta temperatura de síntesis favorece las fases menos amorfas que, en consecuencia, pueden reducir las velocidades de disolución. Además, la síntesis a temperatura ambiente tiene la ventaja de reducir los costos energéticos cuando se fabrica a escala.

Si bien puede haber otras formas de formular concentraciones altas y estables de cobre que permitan una liberación sostenida y una rápida disolución de iones cuando sea necesario, no podemos imaginar otra síntesis que sea tan sencilla y el costo de los productos (para los reactivos) tan bajo. Estos son factores importantes, ya que el problema de las infecciones tópicas y la resistencia bacteriana no se limita de ninguna manera a los países desarrollados. Los países en desarrollo están cada vez más afectados por problemas de resistencia bacteriana, por lo que se necesitan con urgencia soluciones asequibles y eficaces [36, 37]. Aunque no hay suficientes estudios para llegar a soluciones concretas, hay evidencia de que la resistencia a los iones metálicos tóxicos es más difícil de lograr para las bacterias que la resistencia a los antibióticos convencionales [7]. La teoría se basa en la idea de que el cobre y la plata probablemente no tienen vías discretas de actividad antimicrobiana, sino que pueden afectar a múltiples objetivos, incluidos varios sistemas enzimáticos, y por tanto pueden desestabilizar la estructura celular bacteriana general [17, 19, 38]. De hecho, se ha demostrado que las bacterias siguen siendo susceptibles al cobre y a ciertos iones de otros metales a pesar de las exposiciones durante siglos [6, 7, 39]. Curiosamente, existe evidencia reciente de que los antimicrobianos a base de metales pueden incluso devolver la sensibilidad bacteriana a los antibióticos convencionales a pesar de la resistencia previa [40, 41].

Conclusiones

Aquí, hemos demostrado que el problema de los iones de cobre biodisponibles, a pH fisiológicos y altas concentraciones, puede resolverse dopando un nanomineral de cobre con ácidos orgánicos, en una estrategia similar a la utilizada anteriormente para los análogos de hierro [21, 22]. Estas nanopartículas a base de cobre (denominadas CHAT) se disolvieron fácilmente en el medio bacteriano, mostrando una absorción de cobre intracelular y una actividad antibacteriana equivalentes a las sales de cobre solubles. Sin embargo, fundamentalmente, ya diferencia de las sales de cobre simples, el CHAT se puede concentrar en una formulación de pH neutro y conservar su labilidad en términos de liberación de iones de cobre. De hecho, CHAT liberó iones de cobre dentro del rango bactericida y, por lo tanto, podría ser la base de un nuevo agente antimicrobiano tópico, ya sea solo o mejorando la eficacia de la resistencia a los antibióticos. Con el aumento de la resistencia a los antibióticos, se necesitan nuevos antimicrobianos tópicos y el CHAT es económico, se sintetiza fácilmente y utiliza componentes que generalmente se reconocen como seguros (GRAS). Se merecen estudios in vivo.

Abreviaturas

CHAT:

Nanopartículas de tartrato de adipato de hidróxido de cobre [oxo]

CuO NP:

Nanopartículas de óxido de cobre

DLS:

Dispersión de luz dinámica

Escherichia coli :

E. coli

GRAS:

Generalmente reconocido como seguro

HEC:

Hidroxietilcelulosa

HMM:

MOPS de metales pesados ​​mediano

HPLC:

Cromatografía líquida de alto rendimiento

ICP-OES:

Espectrometría de emisión óptica de plasma acoplada inductivamente

IHAT:

Nanopartículas de tartrato de adipato de hidróxido de hierro

MOPS:

3- ( N -ácido morfolino) propanosulfónico

Staphylococcus aureus :

S. aureus

UHP:

Pureza ultra alta

Estudio comparativo de las propiedades electroquímicas, biomédicas y térmicas de nanomateriales naturales y sintéticos Revisar la aplicación de silicio negro nanoestructurado