Imágenes biológicas multiplexadas hiperespectrales de nanoprobes emitidas en la región infrarroja de onda corta

Introducción

Las tecnologías de imágenes biomédicas se están desarrollando rápidamente en las últimas décadas, lo que permite la detección temprana y la evaluación de diversas enfermedades y patologías. Entre las diferentes modalidades de imagen, la imagen óptica ocupa una posición única debido a su alta resolución espacial y temporal y su costo relativamente bajo. Se están desarrollando y traduciendo clínicamente múltiples enfoques de imágenes ópticas basados ​​en fotoluminiscencia (o, más específicamente, fluorescencia). Por ejemplo, las imágenes del sistema linfático y la cirugía guiada por imágenes de fluorescencia intraoperatoria han mostrado resultados prometedores para el avance de la atención médica [1, 2]. Por otro lado, las sondas fotoluminiscentes exógenas que se dirigen a regiones específicas de interés (por ejemplo, un tumor) se desarrollan activamente para la obtención de imágenes in vivo y ex vivo. Además de los requisitos habituales para las sondas de fotoluminiscencia (PL) (es decir, alta absorbancia, rendimiento cuántico de emisión y fotoestabilidad), la posición espectral y la forma de la emisión de PL también son parámetros vitales a considerar. Como se sabe que la atenuación de la luz por los tejidos biológicos es menor en el rango espectral del infrarrojo cercano (NIR) (~ 700-950 nm) que en el visible, la existencia de la ventana de transparencia NIR para los tejidos biológicos (~ 700- 950 nm) y se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo y las aplicaciones de las sondas emisoras NIR [3, 4, 5, 6]. Además, los avances recientes llevaron a la introducción de la segunda y tercera ventanas NIR (NIR-II y NIR-III) en el rango espectral de ~ 1000-1700 nm, que a menudo se denomina infrarrojo de onda corta (SWIR), especialmente por fabricantes en el campo de rápido desarrollo de la imagen infrarroja [7, 8, 9]. A pesar de una mayor absorción de agua en el rango SWIR en comparación con la ventana NIR convencional, la menor autofluorescencia y la dispersión de los tejidos biológicos permiten una resolución de imagen superior y una mayor profundidad de imagen en la bioimagen SWIR PL [10,11,12]. Por ejemplo, en imágenes SWIR PL de vasos linfáticos y cerebrales, utilizando el nuevo colorante fluorescente SWIR CH1055-PEG, se demostró que la resolución y la relación señal / fondo eran superiores en comparación con las imágenes convencionales NIR PL con colorante fluorescente NIR-I, verde de indocianina [13]. Además, el uso de las nanotubos emisores de SWIR (nanotubos de carbono de pared simple) y la cámara de imágenes SWIR permitió al grupo de Dai visualizar vasos de menos de 10 μm a una profundidad de> 2 mm en imágenes no invasivas (sin craneotomía) de cerebrovasculatura de ratones, que es inaccesible para imágenes PL en rangos visibles o NIR-I [8].

Los tintes orgánicos y los complejos de tintes con absorción intensa en la primera ventana NIR y fluorescencia en la ventana NIR-II podrían considerarse sondas NIR-SWIR prometedoras; se demostró que sirven como un agente de contraste excepcional para la obtención de imágenes de la vasculatura y los ganglios linfáticos, la delimitación del tumor y la cirugía guiada por imágenes [13,14,15,16]. Vale la pena señalar que el colorante orgánico verde de indocianina (ICG) es el único agente de contraste de fluorescencia NIR aprobado actualmente por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. Para su uso en humanos [17]. Al mismo tiempo, las sondas de imágenes moleculares (es decir, tintes o complejos de tintes) tienen limitaciones asociadas con la necesidad de modificar su estructura molecular para cambiar sus características de bio-sonda (p. Ej., Solubilidad en agua, permeabilidad celular, etc.) o proporcionarles otras imágenes o modalidades de focalización. Por el contrario, las nanopartículas (NP) que comprenden centros PL pueden tener su superficie modificada covalentemente con diferentes restos para mejorar la dispersabilidad y estabilidad del agua, la carga superficial controlada o con fines de focalización. Además, la introducción de nanoplataformas NIR-SWIR PL permite la combinación de imágenes PL con otras modalidades de imágenes, diagnóstico o terapéuticas. Estudios recientes informan de imágenes de tejido profundo, cuerpo entero, tumorales o transcraneales con nanoformulaciones emisoras de SWIR utilizadas para monitorear varios procesos in vivo [14, 18, 19, 20, 21]. Entre las diversas nanosensas emisoras NIR-SWIR notificadas para la obtención de imágenes in vivo, se pueden distinguir dos tipos:con fluorescencia NIR-SWIR que surge de restos orgánicos (es decir, polímero conjugado) o nanocristales cerámicos (p. Ej., Fluoruro) dopados con iones de tierras raras. Las nanopartículas basadas en polímeros (PNP) se encuentran entre las nanomedicinas de mayor éxito en las traducciones clínicas, debido a su relativa facilidad de síntesis y funcionalización química, así como a su superior biocompatibilidad y biodegradabilidad [22]. Cuando se cargan con fluoróforos NIR-SWIR, los PNP pueden servir como sondas de imagen prometedoras o como vehículos de administración de fármacos guiados por imágenes [23, 24]. Por otro lado, las nanopartículas dopadas con iones de tierras raras (RENP) son una clase bien conocida de nanoprobes, que tienen propiedades de fotoluminiscencia únicas accesibles a través de procesos de conversión ascendente (anti-desplazamiento de Stokes) y de conversión descendente (desplazamiento de Stokes). [25,26,27,28,29,30]. Recientemente, los RENP se han traducido para su uso en imágenes NIR-SWIR. A diferencia de las sondas NIR-SWIR basadas en restos orgánicos, poseen un alto rendimiento cuántico, una fotoestabilidad excepcional y bandas de emisión estrechas en toda la región espectral NIR-SWIR, que pueden sintonizarse mediante dopaje con varios iones [20, 31, 32]. Los RENP se aplicaron a la obtención de imágenes de órganos y vasculatura de animales pequeños, detección de tumores, imágenes multiplexadas y multiespectrales [3, 19, 20, 33,34,35].

Con el desarrollo emergente de la bioimagen de PL, se puede requerir la capacidad de rastrear simultáneamente varios restos de PL in vivo para diferentes propósitos (por ejemplo, imágenes dirigidas de las células u órganos seleccionados junto con la administración de fármacos guiada por imágenes). Para abordar este desafío, se desarrollaron métodos de imágenes multiplexados. Las imágenes multiplexadas se refieren a la complementariedad de la información anatómica y funcional en el sistema biológico de la imagen; su aplicación puede permitir la combinación de biomarcadores de imagen, contrastes y modalidades para aumentar la utilidad de la imagen en aplicaciones clínicas y de investigación [36]. Las imágenes PL multiplexadas pueden mejorar la dimensión teranóstica de la nanomedicina, ofreciendo la capacidad de introducir varios contrastes de imágenes PL junto con la modalidad terapéutica. Los métodos de obtención de imágenes multiplexados más utilizados distinguen las sondas PL por la posición espectral de su emisión PL, utilizando filtros ópticos apropiados [37,38,39]. Sin embargo, la multiplexación adecuada en tal enfoque requiere la utilización de nanoprobes con espectros PL espectralmente estrechos y no superpuestos. En este sentido, la imagen hiperespectral (HSI) combinada con algoritmos de análisis de mezcla espectral es una herramienta prometedora para la multiplexación PL. Sin embargo, las aplicaciones biomédicas de PL HSI se limitan en su mayoría a la microscopía de fluorescencia, para multiplexar diferentes tipos de nanoprobes y eliminar el fondo y la autofluorescencia [40, 41]. Con respecto al HSI in vivo, se utiliza con mayor frecuencia en el modo de imágenes de reflexión a través de la adquisición y el análisis secuencial de los espectros de reflexión del tejido [42], aunque también se ha informado de imágenes de HSI in vivo (también llamadas imágenes multiespectrales) para PL en visible y rangos de NIR [3, 5]. Sin embargo, no se pudieron encontrar en la literatura informes sobre HSI de nanoprobes emisores de SWIR.

Recientemente, hemos informado del desarrollo de un sistema HSI secuencial de banda combinado con software de desmezcla espectral para imágenes SWIR PL [43]. El procedimiento HSI secuencial de banda se basó en la adquisición consecutiva de imágenes 2D a través de un elemento con transmitancia espectralmente variada (es decir, filtro sintonizable de cristal líquido, LCTF). Los datos SWIR PL obtenidos de las suspensiones de RENP se presentaron como un cubo de datos espectrales tridimensionales (hipercubo) que comprende dos dimensiones espaciales y una espectral. La aplicación adicional del procedimiento de desmezcla espectral a cada píxel espacial del hipercubo adquirido permitió el cálculo de abundancias en un componente de mezcla PL. En este documento, aplicamos HSI para abordar la multiplexación de nanoprobes para la bioimagen SWIR PL in vivo. Utilizamos dos tipos de nanopartículas emisoras de SWIR con emisiones que se superponen espectralmente y no se pueden distinguir fácilmente en una imagen PL convencional con filtros ópticos, a pesar de su perfil espectral diferente. La Figura 1 ilustra el problema de la mezcla espectral de PL a partir de estas nanopartículas y la forma de superarlo mediante la desmezcla secuencial de bandas con HSI.

Esquema que ilustra la aplicación de HSI para multiplexar nanoprobes fotoluminiscentes

El HSI se aplicó para adquirir imágenes PL sensibles y espectralmente selectivas para ambos tipos de nanopartículas. Para desmezclar los perfiles espectrales SWIR PL, se desarrolló el protocolo de desmezcla, que nos permite obtener mapeo cuantitativo y espacial de componentes en la mezcla, con determinación de distribuciones de intensidad además de abundancias. Las técnicas SWIR HSI y el protocolo de desmezcla desarrollado se aplicaron además a la obtención de imágenes in vivo de ratones inyectados subcutáneamente con nanopartículas para demostrar la aplicabilidad de HSI para multiplexar las nanoprobes SWIR PL en las imágenes in vivo.

Métodos

Preparación y caracterización de nanoformulaciones

Síntesis de nanopartículas poliméricas de núcleo y cubierta cargadas con tinte orgánico fluorescente NIR-SWIR

Poliestireno (PS) -poly- N -isopropilacrilamida (PNIPAM) nanopartículas núcleo-capa se sintetizaron mediante polimerización en microemulsión, con la modificación del método descrito anteriormente [44, 45]. Primero, se prepararon nanopartículas de núcleo de PS-co-PNIPAM (10% en peso de PNIPAM) como sigue. NIPAM (0,1 g), SDS de dodecilsulfato de sodio (0,1 g) y 0,005 g de NaH ₂ PO ₄ × H ₂ O se disolvieron en 45 ml de H ₂ Se añadió gota a gota estireno (1 g) con agitación vigorosa cuando la temperatura se aumentó a 60ºC. En el siguiente paso, se burbujeó Ar en la mezcla durante 30 min, la temperatura se elevó a 70 ° C y 0,08 g de K ₂ S ₂ O ₈ disuelto en 1 ml de H ₂ Se inyectó O para iniciar la polimerización. En segundo lugar, se colocó una capa de PNIPAM sobre el núcleo de PS-co-PNIPAM. Para ello, al reactor se le añadió una solución acuosa de monómero NIPAM (1,8 g) y reticulante N , N ′ -Metilenbisacrilamida (BIS) (0,18 g) en 4 ml de H ₂ O usando una jeringa. Se dejó que la reacción continuara durante 4 ha 70ºC. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se dializó durante 74 h usando membrana de celulosa con MWCO 3500 Da. Como resultado, se fabricó la suspensión de las nanopartículas de PS-PNIPAM; Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) revelan claramente una estructura de núcleo-capa de las nanopartículas (Fig. 3a). Para obtener PNP fluorescentes NIR-SWIR, 2-butil-6- [5- (2-butil-1,3-dimetilciclo-hepta [c] pirrol-6 (2H) -iliden) penta-1,3-dien El colorante fluorescente de -1-il] -1,3-dimetilciclohepta [c] pirrolio (marcado como JB9-08) [46] se cargó posteriormente [47] en nanopartículas de PS-PNIPAM. Se agregaron ocho microlitros de solución de colorante JB9-08 1 mM en DMF a 2 ml de suspensión de agua de PNP al 0,25% en peso y se mantuvieron durante 24 h antes de su uso.

Síntesis de los RENP de Core-Shell

Los RENP se sintetizaron siguiendo el protocolo modificado informado en otro lugar [48]. Primero, el α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ Las nanopartículas centrales se prepararon mediante la descomposición del trifluoroacetato de metal a alta temperatura. En un procedimiento típico, 0.05 mmol Yb ₂ O ₃ , 0,15 mmol Nd ₂ O _3, y 0,25 mmol Y ₂ O ₃ se cargaron en un matraz de 250 ml que contenía 5 ml de agua desionizada y 5 ml de TFA y se calentaron a 90 ° C durante 1 h para producir una solución transparente. La solución transparente resultante se evaporó a esta temperatura bajo purga de argón para obtener RE (TFA) ₃ en polvo fangoso. . Posteriormente, se añadieron al matraz 8 ml de OA, 8 ml de OM, 12 ml de ODE y 2 mmol de NaTFA. La solución se calentó a 120 ° C y se mantuvo a esa temperatura durante 30 min, seguido de calentamiento hasta 300 ° C durante 30 min antes de enfriarse naturalmente a temperatura ambiente. Se aplicó un ambiente de argón durante todo el proceso de síntesis. Las nanopartículas resultantes se precipitaron añadiendo 20 ml de etanol al matraz de reacción enfriado. Después de un lavado centrífugo con etanol tres veces, el polvo blanco recogido se dispersó finalmente en 10 ml de hexano para usos posteriores.

En segundo lugar, el α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ Los RENP de núcleo-cáscara se prepararon mediante un proceso de crecimiento epitaxial mediado por semillas, que implica el uso de α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ núcleo como la semilla y el correspondiente crecimiento en la solución precursora de la cáscara. Para preparar el precursor de la cáscara, en primer lugar, se añadieron 2 mmol de CaO con 5 ml de agua desionizada y 5 ml de TFA a un matraz de 250 ml y se calentó a 90 ° C durante 1 h para producir una solución transparente. Luego, esta solución se evaporó a esta temperatura para producir el precursor de la capa de trifluoroacetato de calcio (Ca (TFA) ₂ ). A continuación, 0,5 mmol de NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ Se añadieron al matraz nanopartículas de núcleo, 7 ml de OA y 7 ml de ODE. A continuación, la solución se calentó a 120 ° C durante 30 min, seguido de calentamiento a 300 ° C durante 60 min antes de enfriarse naturalmente. Todo el proceso se llevó a cabo en un ambiente de argón. Las nanopartículas de núcleo-carcasa resultantes se precipitaron añadiendo 20 ml de etanol al matraz de reacción enfriado. Después de un lavado centrífugo con etanol tres veces, las NP de núcleo-corteza recolectadas finalmente se dispersaron en 10 ml de hexano para usos posteriores. Para la preparación de la dispersión acuosa, el α-NaYF ₄ preparado :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ Los RENP core-shell (dispersión de hexano de 5 ml) se mezclaron en primer lugar con 5 ml de N , N -Dimetilformamida (DMF) solución de tetrafluoroborato de nitrosonio (NOBF ₄ ) (0,1 M) a temperatura ambiente. Se aplicó una suave agitación a la mezcla hasta que se observó la precipitación de RENP. Posteriormente, se añadieron tolueno y hexano (1:1, volumen) a la mezcla, que luego se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min. El precipitado se recogió y se dispersó en 5 ml de DMF. En segundo lugar, se agregaron 250 mg de poli (ácido acrílico) (PAA, PM =18.000) a la solución de DMF de 5 ml de NOBF ₄ -RENPs tratados, que se calentó a 80 ° C y se mantuvo a esta temperatura durante 30 min con agitación vigorosa. Después de eso, las NP se precipitaron agregando acetona, se lavaron con etanol y finalmente se dispersaron en agua destilada.

Microscopía electrónica de transmisión

Las morfologías de PNP y RENP se evaluaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para obtener imágenes con TEM, se dejaron caer 10 μL de suspensión de nanopartículas sobre las películas de soporte de carbono estabilizadas con formvar. Para visualizar la estructura núcleo-capa de los PNP, se tiñeron negativamente con una solución acuosa al 1% de ácido fosfotúngstico antes de colocarlos sobre las películas de soporte. Las películas de soporte de carbono se secaron al aire y se lavaron con 5 µl de agua pura. Las imágenes se obtuvieron operando a un voltaje de aceleración de 100 kV en TEM (JEM-1230, JEOL).

Espectroscopía de fotoluminiscencia

Los espectros PL para ambos tipos de nanopartículas se midieron en rangos NIR y SWIR usando un espectrofluorómetro Fluorolog-3 equipado con espectrómetro iHR320 para rango NIR-SWIR (Horiba); Se utilizó un diodo láser de fibra acoplada que emite a 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) para excitar PL de PNP y RENP.

Sistema de imágenes hiperespectrales

El sistema SWIR HSI construido en casa aprovecha el método de adquisición secuencial de banda (Fig.2) e incluye una cámara NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Bélgica), óptica de enfoque (TEC-M55MPW, Computar, EE. UU.) Y filtro sintonizable de cristal líquido (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, EE. UU.) Como elemento dispersivo. El sistema tiene una resolución de 340 × 258 píxeles y funciona en un rango espectral de 900 a 1700 nm. Las fuentes de iluminación en el sistema incluyen lámpara incandescente (para alineación de imagen, enfoque e imagen de campo brillante) y diodo láser de fibra acoplada de 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, EE. UU.), Alimentado con fuente de energía láser (Fuente láser 4308 , Arroyo Instruments, EE. UU.), Para la excitación PL en imágenes PL. La adquisición del cubo de datos espectrales se realizó mediante el ajuste secuencial de la transmitancia LCTF de un ancho espectral de 20 nm en el rango de 900 a 1200 nm con un paso de 10 nm y capturando las imágenes correspondientes. El tiempo de exposición de la cámara NIR durante la adquisición de HSI se estableció en 200 ms. La densidad de potencia del láser en la muestra se fijó en ~ 100 mW / cm ² . Para la adquisición de imágenes PL en todo el rango NIR-SWIR, LCTF se reemplazó por un filtro de paso de 850 nm de largo (Edmund Optics, EE. UU.).

Diagrama esquemático del sistema de imágenes hiperespectrales NIR-SWIR

Software de desmezcla espectral

Para el análisis del cubo de datos espectrales obtenido, desarrollamos un algoritmo de desmezcla espectral utilizando el entorno MATLAB. El espectro de cada píxel se considera como una mezcla lineal de miembros finales conocidos:\ (F \ left (\ lambda \ right) =\ sum \ limits_i {a} _i {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), donde F ( λ ):Espectro de píxeles, G _i - espectros de miembros finales y a _i hay abundancia de miembros finales. El propósito del software de desmezcla es estimar la abundancia de miembros finales conocidos resolviendo el problema del análisis de mezcla espectral lineal (LSMA) en cada píxel del cubo de datos espectrales adquiridos. Supongamos, L es el número de bandas espectrales y p es el número de miembros finales presentes en una mezcla. Entonces, el problema de LSMA puede indicarse como F = Ga + n , donde F es L × 1 vector de intensidades de píxeles, G es L × p matriz que contiene todos los vectores de miembros finales, a es p × 1 vector de abundancias desconocidas y n es L Vector de error × 1. El método basado en el error de mínimos cuadrados (LSE) para resolver el problema de LSMA puede formarse como la siguiente tarea de optimización:min _a {( F - Ga ) ^T ( F - Ga )}, y la solución clásica es a ( r ) =( G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . Sin embargo, dicha solución puede contener valores negativos de abundancia, que no tienen ningún significado físico. Para resolver este obstáculo, se debe modificar la tarea de optimización de LSE:min _a {( F - Ga ) ^T ( F - Ga )}, sujeto a a ≥ 0. Para resolver esta tarea, utilizamos un algoritmo iterativo, basado en el análisis de mezcla espectral lineal con restricciones de no negatividad (NC-LSMA) que se describe en detalle en [49, 50]. Después del cálculo de abundancias para cada componente, se mapean como gráficos de mapa de colores 2D. Finalmente, el software de desmezcla produce imágenes de intensidad de los componentes correspondientes, basadas en las abundancias obtenidas:\ ({I} _i \ left (x, y \ right) ={a} _i \ left (x, y \ right) \ sum \ limits_ {\ lambda} {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), donde I _i ( x , años ) —Intensidad integral de i -th endmember en pixel, y a _i ( x , años ) - i -ésima abundancia.

Experimentos con animales

Los ratones desnudos BALB / c (Fuente:The Jackson Laboratory, EE. UU.) Se criaron en condiciones oscuras y asépticas en una instalación para animales pequeños. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los criterios del Reglamento Nacional de China para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Antes de la formación de imágenes, se anestesiaron ratones desnudos macho (6 semanas de edad, 20 ± 2 g) con hidrato de cloral al 5% (0,06 ml por gramo de peso del ratón) mediante inyección intraperitoneal. Para la obtención de imágenes SWIR PL in vivo, las nanopartículas se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x y se inyectaron subcutáneamente en los ratones 100 μL de cada suspensión de PBS de PNP, RENP o su mezcla.

Resultados y discusión

Se prepararon dos tipos de NP fotoluminiscentes SWIR para su uso en HSI:(1) PNP poscargadas con colorante JB9-08, que es prácticamente no fluorescente en soluciones acuosas [46] pero, como hemos demostrado [51], restaura su fluorescencia en agua a través de la carga posterior en la matriz polimérica de PNP (Fig. 3a yb) y (2) NaYF ₄ recubierto con PAA :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ nanopartículas dopadas con iones de tierras raras núcleo-capa (RENP, Fig. 3c yd). Nd ³⁺ Los iones en el núcleo de los RENP se pueden excitar con ~ 808 nm de luz ( ⁴ Yo _2/9 → ⁴ F _5/2 transición) y transferir energía a Yb ³⁺ iones, que emiten en un rango de 950 a 1100 nm con un pico de ~ 975 nm ( ² F _5/2 → ² F _7/2 transición). El núcleo de RENP se revistió con CaF ₂ inerte caparazón para reducir las pérdidas no radiativas a través de defectos superficiales y la interacción con el entorno circundante [48]. Ambas nanoformulaciones exhiben fotoluminiscencia en un rango de 900-1200 bajo una excitación de 808 nm (Fig. 3e).

Caracterización de PNP y RENP. Imagen TEM ( a ) y estructura esquemática ( b ) de PNP cargados con colorante JB9-08. Imagen TEM ( c ) y estructura esquemática ( d ) de los RENP. e Espectros de emisión PL normalizados de suspensiones PNPs-JB9-08 y RENPs bajo excitación de 808 nm. Barras de escala, 100 nm

Cabe señalar que los espectros de emisión PL de las nanopartículas obtenidas con espectrofluorómetro no se pueden utilizar como miembros finales en el software de desmezcla espectral por dos razones. En primer lugar, la sensibilidad del sistema HSI no se corrige espectralmente, a diferencia del espectrofluorómetro convencional, por lo que el perfil espectral de emisión adquirido es diferente para dos métodos de adquisición. En segundo lugar, las tramas HSI se recopilan con un paso de 10 nm, aunque el ancho de banda espectral de LCTF es de 20 nm. Eso da como resultado que la señal se superponga en los fotogramas vecinos, lo que provoca una distorsión del perfil espectral obtenido en comparación con el medido con el espectrofluorómetro. Para superar estos obstáculos, se adquirieron miembros finales (perfiles espectrales de muestras PNP y RENP) con el sistema HSI. Con este objetivo, ambos tipos de nanosensas se suspendieron en PBS y sus suspensiones de PBS se colocaron en tubos de microcentrífuga (Fig. 4a). Difícilmente es posible diferenciar dos muestras con imágenes de PL convencionales, ya que sus espectros de emisión de PL se superponen (Figs. 4b y 3e). Usando el sistema HSI, se recolectaron 31 imágenes PL en un rango espectral de 900 a 1200 nm con un paso de 10 nm (Figura 4c). Los perfiles espectrales de PNP, RENP y fondo (BG) se calcularon a través de la dimensión espectral del cubo de datos espectrales promediando la señal en áreas marcadas por cuadrados rojos, azules y verdes, correspondientemente (Figura 4b). Se encontró que los perfiles espectrales obtenidos para PNP y RENP (Fig. 4d) eran similares a los medidos por espectrofluorómetro y luego se usaron como miembros finales para la desmezcla espectral. A partir de entonces, con PNP, RENP y perfiles espectrales BG como miembros finales, las abundancias de componentes correspondientes se calculan y se mapean como gráficos de mapas de colores 2D (Fig. 4e). Las abundancias se calcularon para cada píxel espacial del hipercubo y se representaron como un valor de 0 a 1, donde 0 y 1 indican la ausencia total y la abundancia total del componente, respectivamente. La suma de las abundancias de todos los componentes en cada píxel es igual a 1. Cabe señalar que el software de desmezclado utilizó umbrales por intensidad de la señal para eliminar errores causados ​​por píxeles de baja intensidad. Si la intensidad máxima de un píxel a lo largo de la dimensión espectral era inferior al 5% del máximo del hipercubo completo, se consideraba que dicho píxel tenía un componente de ruido completamente abundante. Además, se calcularon imágenes de intensidad integral de PNP y RENP considerando las abundancias correspondientes y eliminando el componente de fondo (Fig. 4f). Como se esperaba, tanto el mapeo de abundancia como las imágenes de intensidad integral demuestran una abundancia total de PNP en el tubo derecho y RENP en el tubo izquierdo, con un ligero error causado por la dispersión de la emisión PL y la imperfección del algoritmo de desmezcla.

HSI de tubos de microcentrífuga que contienen RENP y PNP. un Imagen de campo brillante de tubos de microcentrífuga con PNP y RENP suspendidos en PBS. b Imagen PL de muestras de PNP y RENP excitadas con 808 nm (se utilizó un filtro de paso largo de 850 nm para la adquisición de imágenes). c Esquema que ilustra el hipercubo compuesto por marcos HSI. d Perfiles espectrales de PNP, RENP y fondo (BG) promediados a partir del ROI que se muestra en b como cuadrados rojos, azules y verdes, correspondientemente. e Mapas de colores de abundancias de componentes. f Imágenes de intensidad reconstruidas de los componentes PL e imagen fusionada PL / campo brillante

La desmezcla espectral también permite distinguir la mezcla de PNP, RENP. Para demostrar esto, se llenaron tres tubos de microcentrífuga con soluciones de PNP, RENP y su mezcla. Después de la adquisición del hipercubo y del procedimiento de desmezcla espectral, el mapeo de abundancia indica la presencia total de PNP en el primer tubo de microcentrífuga, RENP en el segundo y una mezcla de los dos en el tercero (Fig. 5a). La reconstrucción de las imágenes de intensidad se realizó además para revelar la distribución de intensidad de las señales de PNP y RENP PL en la muestra (Fig. 5b).

HSI de tubos de microcentrífuga que contienen (de izquierda a derecha) RENP, PNP y una mezcla de ambos. un Abundancia de PNP, RENP y antecedentes (BG). b Imágenes de intensidad PL reconstruidas e imagen fusionada PL / campo brillante

Además, hemos demostrado la aplicabilidad de nuestro método HIS para multiplexar las nanoprobes superpuestas espectralmente en imágenes SWIR PL in vivo. Se anestesió al ratón desnudo y se le inyectó subcutáneamente con PNP, RENP y una mezcla de los dos. Las imágenes NIR con filtro de paso de 850 nm de largo muestran tres puntos fotoluminiscentes indistinguibles (Fig. 6a). Después de realizar el HSI y el análisis, el mapeo de abundancias muestra abundancias completas de PNP y RENP en los sitios de inyección superior e inferior, respectivamente, mientras que se identificó una mezcla de dos en el sitio de inyección izquierdo (Fig. 6b). Además, para adquirir la distribución de intensidad PL, se realizó una reconstrucción de intensidad (Fig. 6c). Al ajustar el valor de umbral en el software de desmezcla al 15% (estimado empíricamente), fue posible eliminar el ruido en áreas adyacentes a los puntos de emisión (Fig. 6d). Dichos resultados indican que, a diferencia de la modalidad de imágenes PL convencional, que emplea filtros ópticos largos o de paso de banda, HSI no solo puede trazar un mapa de la distribución de la intensidad en la muestra, sino que también puede multiplexar los componentes presentes en la mezcla identificando el perfil espectral de intensidad en cada píxel de la imagen.

HSI de ratón inyectado por vía subcutánea con PNP (sitio de inyección arriba a la derecha), RENP (abajo a la derecha) y mezcla de RENP / PNP (izquierda). un Campo brillante (SWIR), SWIR PL e imágenes combinadas adquiridas con un filtro de emisión de paso de 850 nm de largo. b Abundancia de PNP, RENP y antecedentes (BG). c Imágenes de intensidad reconstruidas correspondientes. d Imágenes de intensidad PL reconstruidas a partir de abundancias con un nivel de umbral del 15% e imagen fusionada PL / campo brillante.

Por lo tanto, la combinación de adquisición HSI y procesamiento de desmezcla espectral se aplicó en este trabajo para obtener una imagen multiplexada de las nanoprobes SWIR PL que se superponen espectralmente. Sin embargo, se deben considerar algunas cuestiones con respecto a la aplicabilidad de la modalidad HSI. Primero, debido a la adquisición espectralmente estrecha, cada trama HSI trata con una intensidad de señal relativamente baja (especialmente en el caso de la emisión PL espectralmente amplia de los restos orgánicos). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Conclusiones

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Abreviaturas

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Infrarrojo cercano

NP:

Nanopartículas

PL:

Fotoluminiscencia

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PD:

Poliestireno

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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