Imagen Hiperespectral Avanzada para la Detección Multiplexada de Nanoprobes de Infrarrojo de Onda Corta en Sistemas Biológicos

Resumen

La bioimagen óptica con luminóforos exógenos que emiten en la región espectral del infrarrojo de onda corta (SWIR, ~1000–1700 nm) es un campo en rápido desarrollo, y recientemente se ha informado el desarrollo de múltiples nanoprobes fotoluminiscentes en el SWIR. En este sentido, la imagen hiperespectral (HSI), combinada con algoritmos de desmezcla, es una herramienta prometedora que permite el multiplexado eficiente de nanoagentes emisores en el SWIR mediante sus perfiles espectrales de fotoluminiscencia (FL). La técnica de HSI en el SWIR presentada aquí se desarrolló para multiplexar dos tipos de nanoprobes: nanopartículas poliméricas dopadas con colorante orgánico (PNPs) y nanopartículas de fluoruro dopadas con tierras raras (RENPs). Ambos tipos exhiben FL en el mismo rango espectral (~900–1200 nm), lo que dificulta su separación espectral con filtros ópticos y limita las posibilidades de imagen multiplexada en tejidos biológicos. Al aplicar HSI en el SWIR, explotamos las diferencias en los perfiles espectrales de FL y logramos una imagen selectiva y sensible de la señal de FL de cada tipo de nanopartícula. La desmezcla de los datos adquiridos permitió el multiplexado de los nanoprobes con espectros superpuestos mediante su perfil de FL. Se obtuvieron tanto la distribución cuantitativa como la espacial de cada tipo de nanopartícula a partir de sus suspensiones mixtas. Finalmente, la técnica de HSI en el SWIR con el protocolo de desmezcla se aplicó a la imagen in vivo de ratones inyectados subcutáneamente con PNPs y RENPs, demostrando exitosamente la aplicabilidad de las técnicas hiperespectrales para multiplexar nanoprobes en imagen in vivo.

Introducción

Las tecnologías de imagen biomédica han avanzado rápidamente en las últimas décadas, permitiendo la detección temprana y la evaluación de diversas enfermedades y patologías. Entre las diferentes modalidades de imagen, la imagen óptica ocupa una posición única debido a su alta resolución espacial y temporal y su costo relativamente bajo. Múltiples enfoques de imagen óptica basados en fotoluminiscencia (o, más específicamente, fluorescencia) están en desarrollo y traducción clínica. Por ejemplo, la imagen del sistema linfático y la cirugía guiada por imagen de fluorescencia intraoperatoria han mostrado resultados prometedores para avanzar en la atención médica [1, 2]. Por otro lado, se desarrollan activamente sondas fotoluminiscentes exógenas que apuntan a regiones de interés específicas (p. ej., tumores) para imagen in vivo y ex vivo. Además de los requisitos habituales para sondas de FL (alta absorbancia, rendimiento cuántico de emisión y fotostabilidad), la posición y forma espectral de la emisión de FL son parámetros vitales. Como se sabe que la atenuación de la luz por tejidos biológicos es menor en el rango del infrarrojo cercano (NIR, ~700–950 nm) que en el visible, se ha introducido la existencia de una "ventana de transparencia NIR" para tejidos biológicos (~700–950 nm) y se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo y aplicaciones de sondas emisoras en el NIR [3–6]. Además, avances recientes llevaron a la introducción de la segunda y tercera ventanas NIR (NIR-II y NIR-III) en el rango espectral de ~1000–1700 nm, a menudo denominado infrarrojo de onda corta (SWIR), especialmente por fabricantes en el campo en rápido desarrollo de la imagen infrarroja [7–9]. A pesar de una mayor absorción de agua en el rango SWIR en comparación con la ventana NIR convencional, la menor autofluorescencia y dispersión de los tejidos biológicos permiten una resolución de imagen superior y mayor profundidad de imagen en la bioimagen de FL en el SWIR [10–12]. Por ejemplo, en la imagen de FL en el SWIR de la vasculatura linfática y cerebral, usando el nuevo colorante fluorescente SWIR CH1055-PEG, se mostró que la resolución y la relación señal-fondo eran superiores en comparación con la imagen de FL NIR convencional con el colorante NIR-I verde de indocianina [13]. Además, el uso de nanoprobes emisores en el SWIR (nanotubos de carbono de pared simple) y una cámara de imagen SWIR permitió al grupo de Dai visualizar vasos sub-10 μm a una profundidad de >2 mm en imagen no invasiva (sin craneotomía) de la cerebrovasculatura de ratones, inaccesible para la imagen de FL en rangos visible o NIR-I [8].

Los colorantes orgánicos y complejos de colorantes con intensa absorción en la primera ventana NIR y fluorescencia en la ventana NIR-II pueden considerarse sondas NIR-SWIR prometedoras; se ha demostrado que sirven como agentes de contraste excepcionales para imagen de vasculatura y ganglios linfáticos, delimitación de tumores y cirugía guiada por imagen [13–16]. Cabe destacar que el colorante orgánico verde de indocianina (ICG) es el único agente de contraste de fluorescencia NIR aprobado actualmente por la FDA de EE. UU. para uso en humanos [17]. Al mismo tiempo, las sondas de imagen molecular (colorantes o complejos de colorantes) tienen limitaciones asociadas a la necesidad de modificar su estructura molecular para cambiar sus características de bioprobos (p. ej., solubilidad en agua, permeabilidad celular) o dotarlos de otras modalidades de imagen o direccionamiento. En cambio, las nanopartículas (NPs) que comprenden centros de FL pueden tener su superficie modificada covalentemente con diferentes grupos para mejorar la dispersibilidad y estabilidad en agua, carga superficial controlada o propósitos de direccionamiento. Además, la introducción de nanoplataformas de FL NIR-SWIR permite combinar la imagen de FL con otras modalidades de imagen, diagnóstico o terapéutica. Estudios recientes reportan imagen de tejido profundo, de cuerpo completo, de tumores o transcraneal con nanoformulaciones emisoras en el SWIR usadas para monitorear diversos procesos in vivo [14, 18–21]. Entre los diversos nanoprobes emisores NIR-SWIR reportados para imagen in vivo, pueden distinguirse dos tipos: con fluorescencia NIR-SWIR que surge de moieties orgánicos (p. ej., polímero conjugado) o nanocristales cerámicos (p. ej., fluoruro) dopados con iones de tierras raras. Las nanopartículas basadas en polímeros (PNPs) se encuentran entre los nanomedicamentos más exitosos en traducciones clínicas, debido a la relativa facilidad en la síntesis y funcionalización química, así como a su superior biocompatibilidad y biodegradabilidad [22]. Cuando se cargan con fluoróforos NIR-SWIR, las PNPs pueden servir como sondas de imagen prometedoras o vehículos de administración de fármacos guiados por imagen [23, 24]. Por otro lado, las nanopartículas dopadas con iones de tierras raras (RENPs) son una clase bien conocida de nanoprobes, que poseen propiedades de fotoluminiscencia únicas accesibles tanto mediante procesos de conversión ascendente (anti-Stokes) como descendente (Stokes) [25–30]. Recientemente, las RENPs se han traducido para su uso en imagen NIR-SWIR. En contraste con las sondas NIR-SWIR basadas en moieties orgánicos, poseen alto rendimiento cuántico, fotostabilidad excepcional y bandas de emisión estrechas en toda la región espectral NIR-SWIR, que pueden ajustarse mediante dopaje con diversos iones [20, 31, 32]. Las RENPs se aplicaron a imagen de vasculatura y órganos de pequeños animales, detección de tumores, imagen multiplexada y multiespectral [3, 19, 20, 33–35].

Con el desarrollo emergente de la bioimagen de FL, la capacidad de rastrear simultáneamente varios moieties de FL in vivo puede ser necesaria para diferentes propósitos (p. ej., imagen dirigida de células u órganos seleccionados junto con administración de fármacos guiada por imagen). Para abordar este desafío, se desarrollaron métodos de imagen multiplexada. La imagen multiplexada se refiere a la complementariedad de información anatómica y funcional en el sistema biológico imagenado; su aplicación puede permitir la combinación de biomarcadores de imagen, contrastes y modalidades para aumentar la utilidad de la imagen en aplicaciones de investigación y clínicas [36]. La imagen multiplexada de FL puede mejorar la dimensión teranóstica de la nanomedicina, ofreciendo la capacidad de introducir varios contrastes de imagen de FL junto con modalidad terapéutica. Los métodos de imagen multiplexada más utilizados distinguen las sondas de FL por la posición espectral de su emisión de FL, usando filtros ópticos apropiados [37–39]. Sin embargo, el multiplexado adecuado en tal enfoque requiere el uso de nanoprobes con espectros de FL estrechos y no superpuestos. En este sentido, la imagen hiperespectral (HSI) combinada con algoritmos de análisis de mezcla espectral es una herramienta prometedora para el multiplexado de FL. Sin embargo, las aplicaciones biomédicas de HSI de FL se limitan principalmente a microscopía de fluorescencia, para multiplexar diferentes tipos de nanoprobes y eliminar el fondo y la autofluorescencia [40, 41]. En cuanto a HSI in vivo, se usa con mayor frecuencia en modo de imagen de reflexión mediante adquisición y análisis secuencial de espectros de reflexión del tejido [42], aunque también se ha reportado HSI in vivo (también llamada imagen multiespectral) para FL en rangos visible y NIR [3, 5]. Sin embargo, no se encontraron informes en la literatura sobre HSI de nanoprobes emisores en el SWIR.

Recientemente, reportamos el desarrollo de un sistema HSI de adquisición secuencial por bandas combinado con software de desmezcla espectral para imagen de FL en el SWIR [43]. El procedimiento HSI secuencial por bandas se basaba en la adquisición consecutiva de imágenes 2D a través de un elemento con transmitancia espectral variable (filtro sintonizable de cristal líquido, LCTF). Los datos de FL en el SWIR obtenidos de suspensiones de RENPs se presentaron como un cubo de datos espectrales tridimensional (hipercubo) que comprende dos dimensiones espaciales y una espectral. La aplicación posterior del procedimiento de desmezcla espectral a cada píxel espacial del hipercubo adquirido permitió el cálculo de abundancias en un componente de mezcla de FL. Aquí, aplicamos HSI para abordar el multiplexado de nanoprobes para bioimagen de FL in vivo en el SWIR. Usamos dos tipos de nanopartículas emisoras en el SWIR con emisiones que se superponen espectralmente y no pueden distinguirse fácilmente en una imagen de FL convencional con filtros ópticos, a pesar de sus diferentes perfiles espectrales. La Figura 1 ilustra el problema de la mezcla espectral de FL de estas nanopartículas y la forma de superarlo usando desmezcla secuencial por bandas con HSI.

Esquema que ilustra la aplicación de HSI para multiplexar nanoprobes fotoluminiscentes

La HSI se aplicó para adquirir imagen de FL selectiva y sensible para ambos tipos de nanopartículas. Para desmezclar los perfiles espectrales de FL en el SWIR, se desarrolló un protocolo de desmezcla, permitiéndonos obtener mapeo cuantitativo y espacial de componentes en la mezcla, con determinación de distribuciones de intensidad además de abundancias. Las técnicas de HSI en el SWIR y el protocolo de desmezcla desarrollado se aplicaron posteriormente a la imagen in vivo de ratones inyectados subcutáneamente con nanopartículas para demostrar la aplicabilidad de HSI para multiplexar nanoprobes de FL en el SWIR en imagen in vivo.

Métodos

Preparación y Caracterización de Nanoformulaciones

Síntesis de Nanopartículas Poliméricas Núcleo-Cáscara Cargadas con Colorante Fluorescente Orgánico NIR-SWIR

Nanopartículas núcleo-cáscara de poliestireno (PS)-poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) se sintetizaron por polimerización en microemulsión, con modificación del método descrito previamente [44, 45]. Primero, se prepararon nanopartículas núcleo de PS-co-PNIPAM (10 % en peso de PNIPAM) de la siguiente manera. NIPAM (0,1 g), dodecilsulfato de sodio SDS (0,1 g) y 0,005 g de NaH₂PO₄ × H₂O se disolvieron en 45 ml de H₂O. Estireno (1 g) se añadió gota a gota con agitación vigorosa cuando la temperatura se elevó a 60 °C. Como siguiente paso, se burbujeó Ar en la mezcla durante 30 min, la temperatura se elevó a 70 °C, y se inyectó 0,08 g de K₂S₂O₈ disuelto en 1 ml de H₂O para iniciar la polimerización. Segundo, se depositó una cáscara de PNIPAM sobre el núcleo PS-co-PNIPAM. Para ello, se añadió al reactor una solución acuosa de monómero NIPAM (1,8 g) y entrecruzante N,N′-metilenbisacrilamida (BIS) (0,18 g) en 4 ml H₂O usando una jeringa. La reacción continuó durante 4 h a 70 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se dializó durante 74 h usando membrana de celulosa con PMCO 3500 Da. Como resultado, se fabricó una suspensión de nanopartículas PS-PNIPAM; una estructura núcleo-cáscara de las nanopartículas se revela claramente en imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 3a). Para obtener PNPs fluorescentes NIR-SWIR, el colorante fluorescente 2-butil-6-[5-(2-butil-1,3-dimetilciclo-hepta[c]pirrol-6(2H)-ilideno)penta-1,3-dien-1-il]-1,3-dimetilciclohepta[c]pirrolio tetrafluoroborato (etiquetado como JB9-08) [46] se post-cargó [47] en nanopartículas PS-PNIPAM. Ocho microlitros de solución 1 mM de colorante JB9-08 en DMF se añadieron a 2 ml de suspensión acuosa de PNPs al 0,25 % en peso y se mantuvo durante 24 h antes de usar.

Síntesis de RENPs Núcleo-Cáscara

Las RENPs se sintetizaron siguiendo un protocolo modificado reportado en otra parte [48]. Primero, se prepararon nanopartículas núcleo α-NaYF₄: 10 % Yb³⁺, 30 % Nd³⁺ mediante descomposición de trifluoroacetato de metal a alta temperatura. En un procedimiento típico, 0,05 mmol Yb₂O₃, 0,15 mmol Nd₂O₃ y 0,25 mmol Y₂O₃ se cargaron en un matraz de 250 ml que contenía 5 ml de agua desionizada y 5 ml de TFA y se calentaron a 90 °C durante 1 h para obtener una solución clara. La solución clara resultante se evaporó a esta temperatura bajo purga de argón para obtener polvo RE(TFA)₃. Posteriormente, se añadieron al matraz 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE y 2 mmol NaTFA. La solución se calentó a 120 °C y se mantuvo a esa temperatura durante 30 min, seguida de calentamiento a 300 °C durante 30 min antes de enfriar naturalmente a temperatura ambiente. Se aplicó un ambiente de argón durante todo el proceso de síntesis. Las nanopartículas resultantes se precipitaron añadiendo 20 ml de etanol al matraz de reacción enfriado. Después de lavado centrífugo con etanol tres veces, el polvo blanco recolectado se dispersó finalmente en 10 ml de hexano para usos posteriores.

Segundo, las RENPs núcleo-cáscara α-NaYF₄: 10 % Yb³⁺, 30 % Nd³⁺@CaF₂ se prepararon mediante un proceso de crecimiento epitaxial mediado por semillas, que involucra el uso de nanopartículas núcleo α-NaYF₄: 10 % Yb³⁺, x % Nd³⁺ como semilla y el crecimiento correspondiente en la solución precursora de la cáscara. Para preparar el precursor de la cáscara, primero se añadieron 2 mmol CaO con 5 ml de agua desionizada y 5 ml TFA a un matraz de 250 ml y se calentaron a 90 °C durante 1 h para producir una solución clara. Esta solución se evaporó luego a esta temperatura para obtener el precursor de la cáscara de trifluoroacetato de calcio (Ca(TFA)₂). A continuación, se añadieron al matraz 0,5 mmol de nanopartículas núcleo NaYF₄: 10 % Yb³⁺, 30 % Nd³⁺, 7 ml OA y 7 ml ODE. La solución se calentó luego a 120 °C durante 30 min, seguida de calentamiento a 300 °C durante 60 min antes de enfriar naturalmente. Todo el proceso se realizó bajo ambiente de argón. Las nanopartículas núcleo-cáscara resultantes se precipitaron añadiendo 20 ml de etanol al matraz de reacción enfriado. Después de lavado centrífugo con etanol tres veces, los NPs núcleo-cáscara recolectados se dispersaron finalmente en 10 ml de hexano para usos posteriores. Para la preparación de la dispersión acuosa, las RENPs núcleo-cáscara α-NaYF₄: 10 % Yb³⁺, 30 % Nd³⁺@CaF₂ preparadas (5 ml dispersión en hexano) se mezclaron primero con 5 ml de solución de tetrahidroborato de nitrosonio (NOBF₄) (0,1 M) en N,N-dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente. Se aplicó una agitación suave a la mezcla hasta observar precipitación de RENPs. Posteriormente, se añadieron tolueno y hexano (1:1, volumen) a la mezcla, que luego se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min. El precipitado se recolectó y dispersó en 5 ml DMF. Segundo, se añadieron 250 mg de poli(ácido acrílico) (PAA, PM = 18 000) a la solución de 5 ml DMF de RENPs tratadas con NOBF₄, que se calentó a 80 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 30 min bajo agitación vigorosa. Después, las NPs se precipitaron añadiendo acetona, se lavaron con etanol y finalmente se dispersaron en agua destilada.

Microscopía Electrónica de Transmisión

Las morfologías de PNPs y RENPs se evaluaron usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para ser imagenadas con TEM, 10 μl de suspensión de nanopartículas se depositaron sobre películas de soporte de carbono estabilizadas con formvar. Para visualizar la estructura núcleo-cáscara de PNPs, se tiñeron negativamente con solución acuosa al 1 % de ácido fosfotúngstico antes de depositar sobre las películas de soporte. Las películas de soporte de carbono se secaron al aire y se lavaron con 5 μl de agua pura. Las imágenes se obtuvieron operando a un voltaje de aceleración de 100 kV en TEM (JEM-1230, JEOL).

Espectroscopía de Fotoluminiscencia

Los espectros de FL para ambos tipos de nanopartículas se midieron en rangos NIR y SWIR usando un espectrofluorómetro Fluorolog-3 equipado con espectrómetro iHR320 para rango NIR-SWIR (Horiba); un diodo láser acoplado a fibra que emite a 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) se usó para excitar la FL de PNPs y RENPs.

Sistema de Imagen Hiperespectral

El sistema HSI SWIR casero explota el método de adquisición secuencial por bandas (Fig. 2) e incluye cámara NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Bélgica), óptica de enfoque (TEC-M55MPW, Computar, EE. UU.) y filtro sintonizable de cristal líquido (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, EE. UU.) como elemento dispersivo. El sistema tiene resolución de 340 × 258 píxeles y opera en rango espectral de 900–1700 nm. Las fuentes de iluminación en el sistema incluyen lámpara incandescente (para alineación de imagen, enfoque e imagen de campo claro) y diodo láser acoplado a fibra de 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, EE. UU.), alimentado con fuente de potencia láser (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, EE. UU.), para excitación de FL en imagen de FL. La adquisición del cubo de datos espectrales se realizó mediante sintonización secuencial de la transmitancia del LCTF de ancho espectral de 20 nm en el rango de 900 a 1200 nm con paso de 10 nm y captura de imágenes correspondientes. El tiempo de exposición de la cámara NIR durante la adquisición HSI se fijó en 200 ms. La densidad de potencia láser en la muestra se fijó en ~100 mW/cm². Para la adquisición de imágenes de FL en todo el rango NIR-SWIR, el LCTF fue reemplazado por filtro de paso largo de 850 nm (Edmund Optics, EE. UU.).

Diagrama esquemático del sistema de imagen hiperespectral NIR-SWIR

Software de Desmezcla Espectral

Para el análisis del cubo de datos espectrales obtenido, desarrollamos un algoritmo de desmezcla espectral usando el entorno MATLAB. El espectro de cada píxel se considera una mezcla lineal de endmembers conocidos: \( F(\lambda) = \sum_i a_i G_i(\lambda) \), donde \( F(\lambda) \) — espectro del píxel, \( G_i \) — espectros de endmembers, y \( a_i \) son abundancias de endmembers. El propósito del software de desmezcla es estimar las abundancias de endmembers conocidos resolviendo el problema de análisis de mezcla espectral lineal (LSMA) en cada píxel del cubo de datos espectrales adquirido. Supongamos, \( L \) es el número de bandas espectrales, y \( p \) es el número de endmembers presentes en una mezcla. Entonces, el problema LSMA puede plantearse como \( \mathbf{F} = \mathbf{Ga} + \mathbf{n} \), donde \( \mathbf{F} \) es vector \( L \times 1 \) de intensidades de píxel, \( \mathbf{G} \) es matriz \( L \times p \) que contiene todos los vectores de endmembers, \( \mathbf{a} \) es vector \( p \times 1 \) de abundancias desconocidas, y \( \mathbf{n} \) es vector \( L \times 1 \) de error. El método basado en error de mínimos cuadrados (LSE) para resolver el problema LSMA puede formularse como la siguiente tarea de optimización: \( \min_{\mathbf{a}} \{ (\mathbf{F} - \mathbf{Ga})^T (\mathbf{F} - \mathbf{Ga}) \} \), y la solución clásica es \( \mathbf{a}(\mathbf{r}) = (\mathbf{G}^T \mathbf{G})^{-1} \mathbf{G}^T \mathbf{F} \). Sin embargo, tal solución puede contener valores negativos para abundancias, que no tienen significado físico. Para resolver este obstáculo, la tarea de optimización LSE debe modificarse: \( \min_{\mathbf{a}} \{ (\mathbf{F} - \mathbf{Ga})^T (\mathbf{F} - \mathbf{Ga}) \} \), sujeto a \( \mathbf{a} \ge 0 \). Para resolver esta tarea, utilizamos un algoritmo iterativo, basado en análisis de mezcla espectral lineal con restricción de no negatividad (NC-LSMA) descrito en detalle en [49, 50]. Después del cálculo de abundancias para cada componente, se mapean como gráficos de mapa de color 2D. Finalmente, el software de desmezcla produce imágenes de intensidad de los componentes correspondientes, basadas en las abundancias obtenidas: \( I_i(x,y) = a_i(x,y) \sum_\lambda G_i(\lambda) \), donde \( I_i(x,y) \) — intensidad integral del i-ésimo endmember en el píxel, y \( a_i(x,y) \) — i-ésima abundancia.

Experimentos con Animales

Ratones BALB/c desnudos (Fuente: The Jackson Laboratory, EE. UU.) se criaron bajo condiciones oscuras y asépticas en una instalación de animales pequeños. Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo los criterios de la Regulación Nacional de China para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Antes de la imagen, ratones machos desnudos (6 semanas de edad, 20 ± 2 g) fueron anestesiados con hidrato de cloral al 5 % (0,06 ml por gramo de peso del ratón) por inyección intraperitoneal. Para imagen de FL SWIR in vivo, las nanopartículas se suspendieron en solución salina fosfato 10x (PBS) y 100 μl de cada suspensión PBS de PNPs, RENPs o su mezcla se inyectaron subcutáneamente en los ratones.

Resultados y Discusión

Se prepararon dos tipos de NPs fotoluminiscentes en el SWIR para uso en HSI: (1) PNPs post-cargadas con colorante JB9-08, que es virtualmente no fluorescente en soluciones acuosas [46] pero, como mostramos [51], restaura su fluorescencia en agua mediante post-carga en la matriz polimérica de PNPs (Fig. 3a y b) y (2) nanopartículas de tierras raras dopadas con iones recubiertas con PAA NaYF₄:10 % Yb³⁺,30 % Nd³⁺@CaF₂ núcleo-cáscara (RENPs, Fig. 3c y d). Los iones Nd³⁺ en el núcleo de RENPs pueden ser excitados con luz ~808 nm (transición ⁴I₉/₂ → ⁴F₅/₂) y transferir energía a iones Yb³⁺, que emiten en rango 950–1100 nm con pico en ~975 nm (transición ²F₅/₂ → ²F₇/₂). El núcleo de RENPs se recubrió con cáscara inerte de CaF₂ para reducir pérdidas no radiativas a través de defectos superficiales e interacción con el entorno circundante [48]. Ambas nanoformulaciones exhiben fotoluminiscencia en rango 900–1200 bajo excitación a 808 nm (Fig. 3e).

Caracterización de PNPs y RENPs. Imagen TEM (a) y estructura esquemática (b) de PNPs cargadas con colorante JB9-08. Imagen TEM (c) y estructura esquemática (d) de RENPs. e Espectros de emisión FL normalizados de suspensiones PNPs-JB9-08 y RENPs bajo excitación a 808 nm. Barras de escala, 100 nm

Debe notarse que los espectros de emisión FL de las nanopartículas obtenidos con espectrofluorómetro no pueden usarse como endmembers en el software de desmezcla espectral por dos razones. Primero, la sensibilidad del sistema HSI no está corregida espectralmente, a diferencia del espectrofluorómetro convencional, por lo que el perfil espectral de emisión adquirido es diferente para los dos métodos de adquisición. Segundo, los frames HSI se recopilan con paso de 10 nm, aunque el ancho de banda espectral del LCTF es de 20 nm. Esto resulta en superposición de señal en frames vecinos, causando distorsión del perfil espectral obtenido en comparación con el medido con espectrofluorómetro. Para superar estos obstáculos, los endmembers (perfiles espectrales de muestras de PNPs y RENPs) se adquirieron con el sistema HSI. Con este fin, ambos tipos de nanoprobes se suspendieron en PBS y sus suspensiones PBS se colocaron en tubos de microcentrífuga (Fig. 4a). Es difícil diferenciar dos muestras con imagen de FL convencional, ya que sus espectros de emisión FL se superponen (Figs. 4b y 3e). Usando el sistema HSI, se recopilaron 31 imágenes de FL en un rango espectral de 900 a 1200 nm con paso de 10 nm (Fig. 4c). Los perfiles espectrales de PNPs, RENPs y fondo (BG) se calcularon a través de la dimensión espectral del cubo de datos espectrales promediando la señal en áreas marcadas con cuadrados rojo, azul y verde, respectivamente (Fig. 4b). Los perfiles espectrales obtenidos para PNPs y RENPs (Fig. 4d) resultaron similares a los medidos por espectrofluorómetro y se usaron posteriormente como endmembers para la desmezcla espectral. A continuación, con perfiles espectrales de PNPs, RENPs y BG como endmembers, las abundancias de componentes correspondientes se calculan y mapean como gráficos de mapa de color 2D (Fig. 4e). Las abundancias se calcularon para cada píxel espacial del hipercubo y se representaron como un valor de 0 a 1, donde 0 y 1 indican ausencia total y abundancia total del componente, respectivamente. La suma de abundancias de todos los componentes en cada píxel es igual a 1. Cabe notar que el software de desmezcla usó umbralización por intensidad de señal para eliminar errores causados por píxeles de baja intensidad. Si la intensidad máxima de un píxel a lo largo de la dimensión espectral era menor al 5 % del máximo de todo el hipercubo, tal píxel se consideró totalmente abundante en componente de ruido. Además, se calcularon imágenes de intensidad integral de PNPs y RENPs considerando las abundancias correspondientes y eliminando el componente de fondo (Fig. 4f). Como era de esperar, tanto el mapeo de abundancias como las imágenes de intensidad integral demuestran abundancia total de PNPs en el tubo derecho y RENPs en el izquierdo, con ligero error causado por dispersión de emisión FL e imperfección del algoritmo de desmezcla.

HSI de tubos de microcentrífuga que contienen RENPs y PNPs. a Imagen de campo claro de tubos con PNPs y RENPs suspendidos en PBS. b Imagen de FL de muestras PNPs y RENPs excitadas con 808 nm (se usó filtro de paso largo de 850 nm para adquisición de imagen). c Esquema que ilustra el hipercubo compuesto por frames HSI. d Perfiles espectrales de PNPs, RENPs y fondo (BG) promediados de ROI mostrados en b como cuadrados rojo, azul y verde, respectivamente. e Mapas de color de abundancias de componentes. f Imágenes de intensidad reconstruidas de los componentes de FL e imagen fusionada FL/campo claro

La desmezcla espectral también es capaz de distinguir la mezcla de PNPs y RENPs. Para demostrar esto, tres tubos de microcentrífuga se llenaron con soluciones de PNPs, RENPs y su mezcla. Tras la adquisición del hipercubo y el procedimiento de desmezcla espectral, el mapeo de abundancias indica presencia total de PNPs en el primer tubo, RENPs en el segundo, y una mezcla de ambos en el tercero (Fig. 5a). La reconstrucción de imágenes de intensidad se realizó además para revelar la distribución de intensidad de las señales de FL de PNPs y RENPs en la muestra (Fig. 5b).

HSI de tubos de microcentrífuga que contienen (izquierda a derecha) RENPs, PNPs y mezcla de ambos. a Abundancias de PNPs, RENPs y fondo (BG). b Imágenes de intensidad de FL reconstruidas e imagen fusionada FL/campo claro

Hemos demostrado además la aplicabilidad de nuestro método HIS para multiplexar los nanoprobes superpuestos espectralmente en imagen de FL SWIR in vivo. Ratón desnudo fue anestesiado e inyectado subcutáneamente con PNPs, RENPs y una mezcla de ambos. La imagen NIR con filtro de paso largo de 850 nm muestra tres manchas fotoluminiscentes indistinguibles (Fig. 6a). Tras realizar HSI y análisis, el mapeo de abundancias muestra abundancias totales de PNPs y RENPs en los sitios de inyección superior e inferior, respectivamente, mientras que la mezcla de ambos fue identificada en el sitio de inyección izquierdo (Fig. 6b). Además, para adquirir la distribución de intensidad de FL, se realizó reconstrucción de intensidad (Fig. 6c). Al ajustar el valor de umbralización en el software de desmezcla a 15 % (estimado empíricamente), fue posible eliminar ruido en áreas adyacentes a los puntos de emisión (Fig. 6d). Tales resultados indican que, a diferencia de la modalidad de imagen de FL convencional, que emplea filtros ópticos de paso largo o banda, HSI no solo es capaz de mapear la distribución de intensidad en la muestra, sino que también puede multiplexar los componentes presentes en la mezcla identificando el perfil espectral de intensidad en cada píxel de la imagen.

HSI de ratón inyectado subcutáneamente con PNPs (sitio de inyección superior derecho), RENPs (inferior derecho) y mezcla RENPs/PNPs (izquierdo). a Imágenes de campo claro (SWIR), FL SWIR e imagen fusionada adquiridas con filtro de emisión de paso largo de 850 nm. b Abundancias de PNPs, RENPs y fondo (BG). c Imágenes de intensidad reconstruidas correspondientes. d Imágenes de intensidad de FL reconstruidas a partir de abundancias con nivel de umbral del 15 % e imagen fusionada FL/campo claro.

Así, la combinación de adquisición HSI y procesamiento de desmezcla espectral se aplicó en este trabajo para obtener imagen multiplexada de nanoprobes de FL SWIR superpuestos espectralmente. Sin embargo, algunos aspectos deben considerarse respecto a la aplicabilidad de la modalidad HSI. Primero, debido a la adquisición espectralmente estrecha, cada frame HSI trata con intensidad de señal relativamente baja (especialmente en el caso de emisión FL espectralmente ancha de moieties orgánicos). Además, un aumento en la potencia del láser excitador de FL en imagen biológica está limitado por el peligro de daño tisular (o fototoxicidad). Esto resulta en mayores requisitos para el brillo de las sondas de FL y su fotostabilidad, ya que HSI puede requerir un orden de magnitud mayor tiempo de adquisición en comparación con la imagen de FL convencional. También debe notarse que el análisis de mezcla lineal y el algoritmo de desmezcla espectral pueden funcionar satisfactoriamente para imagen multiplexada de FL de tejidos biológicos en el rango espectral donde la transmitancia del tejido no cambia mucho. En contraste, si la transmitancia del tejido tiene características distintivas en el rango espectral de HSI, el modelo de mezcla espectral lineal puede ser difícilmente aplicable (especialmente en caso de tejidos más profundos) y pueden considerarse modelos no lineales.

Conclusiones

En conclusión, desarrollamos una técnica de bioimagen hiperespectral SWIR y la aplicamos para el multiplexado de nanopartículas que emiten en el rango espectral SWIR. Dos tipos de nanopartículas con espectros de FL superpuestos, que son indistinguibles en imagen convencional, fueron multiplexados exitosamente por sus perfiles espectrales de FL usando adquisición hiperespectral junto con algoritmo de análisis de mezcla espectral lineal. El método desarrollado se empleó exitosamente para imagen multiplexada de nanopartículas de FL SWIR tanto en suspensiones de muestra como inyectadas en pequeños animales. Con la bioimagen SWIR teniendo resolución superior a mayor profundidad de imagen, el enfoque HSI SWIR tiene un gran potencial para uso en diversas aplicaciones que requieren imagen multiplexada con nanoprobes de FL NIR-SWIR. Además, como la bioimagen SWIR está en una etapa muy temprana, hay amplio espacio para el desarrollo de aplicaciones biomédicas de sondas de FL en combinación con HSI.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado.

Abreviaturas

BG:

Fondo

HSI:

Imagen hiperespectral

LCTF:

Filtro sintonizable de cristal líquido

NIR:

Infrarrojo cercano

NPs:

Nanopartículas

FL:

Fotoluminiscencia

PNIPAM:

Poli-N-isopropilacrilamida

PNPs:

Nanopartículas poliméricas

PS:

Poliestireno

RENPs:

Nanopartículas de fluoruro dopadas con tierras raras

SWIR:

Infrarrojo de onda corta

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión