Examen de las funciones del tamaño de las gotas de emulsión y del tensioactivo en el proceso de fabricación de nanocristales micelares basado en la inestabilidad interfacial

Observación visual de las gotitas de emulsión y las micelas encapsuladas en QD resultantes después de la evaporación del disolvente orgánico. un No se utilizó PVA. Se formaron pocas o ninguna gota de emulsión ( imagen superior ); se formaron pocas o ninguna micela encapsulada en QD tras la eliminación del disolvente orgánico ( imagen inferior , el recuadro muestra la imagen fluorescente correspondiente usando una lámpara UV de mano para excitar el rojo Fluorescencia QD). b Se usó agitación manual para formar gotitas de emulsión. Se formaron gotas de emulsión de ~ 25 μm ( imagen superior , el recuadro muestra el resultado de la medición del tamaño de las gotas del análisis de imágenes de 500 gotas). Además, se encontró que la variación de tamaño debido a diferentes tiempos de agitación era mínima (Fig. S1). Tras la eliminación del disolvente orgánico, se formó una dispersión transparente y homogénea, lo que indica la formación exitosa de micelas encapsuladas en nanocristales ( imagen inferior , el recuadro muestra la imagen fluorescente correspondiente usando una lámpara UV de mano para excitar el rojo Fluorescencia QD). c Se usó baño de ultrasonidos para formar gotitas de emulsión. Se formaron gotas de emulsión de ~ 3 μm ( imagen superior , el recuadro muestra el resultado de la medición del tamaño de las gotas del análisis de imágenes de 500 gotas). Además, la variación de tamaño debido a los diferentes tiempos de agitación resultó ser mínima (Fig. S1). Tras la eliminación del solvente orgánico, se formó una dispersión transparente y homogénea, lo que indica la formación exitosa de micelas encapsuladas en nanocristales ( imagen inferior , el recuadro muestra la imagen fluorescente correspondiente usando una lámpara UV de mano para excitar el rojo Fluorescencia QD). Para analizar el tamaño de las gotas de emulsión de una muestra en particular, en primer lugar, se tomó una imagen de microscopía óptica de las gotas de emulsión y, posteriormente, se midieron los diámetros de ~ 500 gotas con el software gratuito ImageJ para obtener el tamaño promedio y la distribución de tamaño de las gotitas de emulsión de la muestra

Además, también llevamos a cabo un tratamiento de emulsificación en ausencia del surfactante PVA y descubrimos que prácticamente no se formaron gotas de emulsión con éxito, a juzgar por el resultado del microscopio óptico (Fig. 1a, arriba), y virtualmente, no se formaron micelas con éxito, a juzgar por la observación de una separación de fases casi completa (precipitación QD) en el producto final, es decir, falta de formación del producto micelar (Fig. 1a, parte inferior). Los resultados de la Fig. 1a sugirieron que el tensioactivo PVA es necesario en el proceso de inestabilidad interfacial para la formación satisfactoria de gotitas de emulsión (como los "microrreactores") y de micelas (como productos finales). Esto no es trivial porque sugiere que, aunque PS-PEG también es de naturaleza anfifílica, la presencia de PS-PEG solo (sin la presencia de PVA) en el sistema no puede dar las gotas de emulsión necesarias para el proceso de inestabilidad interfacial.

Aunque las dispersiones del producto parecían transparentes y homogéneas inmediatamente después de su formación (los resultados de caracterización de TEM y DLS mostraron micelas esféricas y monodispersas encapsuladas en QD, archivo adicional 2:Figura S2), la diferencia en el tamaño de las gotas de emulsión dada por los dos diferentes anteriores Se encontró que los métodos de emulsificación, a saber, la agitación manual y la sonicación, conducen a una gran diferencia en los productos de nanocristales micelares. Medimos y seguimos el cambio de intensidad fluorescente de las QD micelares (micelas encapsuladas en QD) formadas por agitación manual y sonicación, respectivamente, durante un período de tiempo de 40 días a 4 ° C. Encontramos que, para el micelar, los QD formados por agitación manual (durante 1 min, formados a partir de gotas de emulsión de ~ 25 μm), aunque la intensidad fluorescente (medida por espectroscopía fluorescente) se mantuvo durante el proceso de formación de micelas, a lo largo del tiempo (~ 10 días), la intensidad de fluorescencia de las QD micelares disminuyó gradualmente hasta aproximadamente solo el 50% del nivel de intensidad fluorescente original y se mantuvo estable después (Fig. 2a). Por el contrario, las QD micelares formadas por sonicación (durante 30 s, formadas a partir de gotas de emulsión de ~ 3 μm) mantuvieron en gran medida la intensidad fluorescente (medida por espectroscopía fluorescente) durante todo el período de tiempo (Fig. 2a). Además, usamos los ojos desnudos para observar la parte inferior de las dispersiones de QD micelares formadas por agitación manual y sonicación, respectivamente, después de dejar las muestras en reposo durante 10 días a 4 ° C. En la parte inferior de las dispersiones QD micelares formadas por agitación manual (durante 1 min) después de 10 días de almacenamiento, se observó un precipitado visible a simple vista (Fig. 2a, recuadro). Por el contrario, en la parte inferior de las dispersiones QD micelares formadas por sonicación (durante 30 s) después de 10 días de almacenamiento, no se observó ningún precipitado visible a simple vista (Fig. 2a, recuadro). Estos resultados sugieren que, aunque ambos métodos de emulsificación podrían conducir a la formación exitosa de micelas encapsuladas en QD con una eficiencia de encapsulación similar, una gran parte de las micelas encapsuladas en QD formadas por gotitas de emulsión más grandes (~ 25 μm, producidas por agitación manual durante 1 min. ) era coloidalmente inestable y con el tiempo provocó precipitación y, por lo tanto, pérdida de fluorescencia de la dispersión, mientras que todas las micelas encapsuladas en QD formadas por gotitas de emulsión más pequeñas (~ 3 μm, producidas por sonicación en baño durante 30 s) se mantuvieron coloidalmente estables y, por lo tanto, se mantuvieron fluorescencia durante un largo período de tiempo (el estudio TEM de la dispersión después de 10 días de almacenamiento también mostró una morfología bien mantenida de nanocristales micelares, como se muestra en el archivo adicional 3:Figura S3). Además, encontramos que, cuando el tiempo de sonicación se incrementó de 30 sa 1 y 2 min para formar gotitas de emulsión, la intensidad fluorescente se redujo drásticamente, aunque las micelas encapsuladas en QD eran coloidalmente estables durante un largo período de tiempo para los diferentes Duraciones del tiempo de tratamiento de sonicación a juzgar por la intensidad fluorescente estable durante todo el tiempo de almacenamiento (Fig. 2b). La pérdida de fluorescencia mostrada en la Fig. 2b probablemente fue causada por la generación de defectos superficiales en los QD por el tratamiento mecánico fuerte y prolongado. En un experimento de control, también se encontró que la intensidad fluorescente de los QD hidrófobos disueltos en cloroformo disminuía gradualmente con el tratamiento de sonicación con un mayor tiempo de sonicación (archivo adicional 4:Figura S4), lo que apoya esta causa propuesta de pérdida de fluorescencia. En conjunto, las Fig. 2a, b revelan los dos mecanismos principales de pérdida de fluorescencia en el sistema de micelas encapsuladas en QD fabricado por el proceso de inestabilidad interfacial, a saber, micelas encapsuladas en QD coloidalmente inestables y defectos superficiales de QD generados por tratamientos mecánicos.

Estabilidad de fluorescencia de micelas encapsuladas en QD fabricadas por el proceso de inestabilidad interfacial. un Cambio de la intensidad de la fluorescencia (medida por espectroscopia fluorescente) a lo largo del tiempo para micelas encapsuladas en QD, con las gotas de emulsión formadas por agitación manual (durante 1 min, es decir, gotas de ~ 25 μm) o sonicación (durante 30 s, es decir, ~ 3 gotas de μm), respectivamente. Los recuadros son imágenes de las dispersiones de micelas encapsuladas en QD después de 10 días de almacenamiento a 4 ° C con las gotas de emulsión formadas por agitación manual (durante 1 min, es decir, gotas de ~ 25 μm) o sonicación (durante 30 s, es decir, ~ 3 gotas de μm), respectivamente. Panel a indica que una causa de pérdida de fluorescencia de micelas encapsuladas en QD es la presencia de micelas encapsuladas en QD coloidalmente inestables. b Cambio de la intensidad de la fluorescencia (medida por espectroscopia fluorescente) a lo largo del tiempo para micelas encapsuladas en QD con las gotas de emulsión formadas por sonicación (es decir, gotas de ~ 3 μm) para tres duraciones de tiempo de tratamiento de sonicación diferentes. Panel b indica que una de las causas de la pérdida de fluorescencia de las micelas encapsuladas en QD son los defectos superficiales de QD generados por un tratamiento mecánico fuerte y prolongado

Entre estos dos mecanismos de pérdida de fluorescencia, aunque es bien sabido que la pérdida de fluorescencia de QD puede ser causada por daños en la superficie de QD, el resultado de que parte de las micelas sean coloidalmente inestables fue una sorpresa para nosotros. Por lo tanto, realizamos más estudios sobre este mecanismo en particular. Primero hicimos la pregunta de si las QD precipitadas mencionadas anteriormente estaban realmente encapsuladas en micelas (o estructuras de ensamblaje similares a micelas). Descubrimos que simplemente sacudir la dispersión con estos precipitados podría llevar a que la intensidad fluorescente de la dispersión regresara al nivel original (Fig. 3a, izquierda); por el contrario, un estudio de control sobre el uso del mismo tratamiento para los QD hidrófobos precipitados en agua no mostró tal aumento de la intensidad fluorescente (Fig. 3a, derecha). Además, las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la parte inferior de las muestras de producto formadas por agitación manual después de 10 días de almacenamiento mostraron un gran número de QD agrupados en grandes estructuras esféricas y no esféricas (Fig. 3b, izquierda); por el contrario, en la parte inferior de las muestras de producto formadas por sonicación después de 10 días de almacenamiento, las imágenes TEM correspondientes solo mostraron un pequeño número de QD agrupados en estructura esférica (Fig. 3b, centro). Por tanto, estos resultados muestran que las QD precipitadas estaban de hecho encapsuladas en micelas o estructuras de ensamblaje similares a micelas, es decir, estas QD no eran QD hidrófobas desnudas. Luego hicimos la pregunta cuál es la naturaleza química de estas micelas coloidalmente inestables (o estructuras de ensamblaje similares a las micelas). Debido a que una micela de PS-PEG debería ser coloidalmente estable, planteamos la hipótesis de que las micelas inestables (o estructuras de ensamblaje similares a las micelas) se formaron mediante el tensioactivo PVA. Esta hipótesis está respaldada por las siguientes dos líneas de evidencia experimental. Primero, descubrimos que el uso de PVA sin PS-PEG en el proceso de inestabilidad interfacial podría resultar en micelas que encapsulan QD (Fig. 3b, derecha). En segundo lugar, realizamos experimentos de diálisis en QD micelares de PS-PEG y QD micelares de PVA, respectivamente, para comparar. Después del tratamiento de diálisis (con el límite de peso molecular de la bolsa de diálisis de 200 kD, que es mayor que los pesos moleculares de PVA y PS-PEG) contra agua pura, las QD micelares de PS-PEG permanecieron coloidalmente estables, a juzgar por el hecho de que la fluorescencia QD permaneció homogénea en la dispersión (Fig. 3c, izquierda). En marcado contraste, la dispersión QD micelar de PVA condujo a agregados fluorescentes claramente visibles después de un tratamiento de diálisis casi idéntico al anterior (Fig. 3c, derecha). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. un Left , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Left and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), respectively. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. un , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. un PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)