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Nuevas nanopartículas dirigidas al receptor CD44 y mitocondrial dual para liberación activada por estímulos redox

Resumen

En este trabajo, se propusieron nanopartículas (micelas) multifuncionales (micelas) nuevas mitocondriales y de receptores CD44 de doble direccionamiento y sensibles a redox basadas en ácido hialurónico oligomérico (oHA). El nanoportador anfifílico se preparó con bromuro de (5-carboxipentil) trifenilfosfonio (TPP), ácido hialurónico oligomérico (oHA), enlace disulfuro y curcumina (Cur), denominada TPP-oHA-S-S-Cur. El TPP se dirigió a las mitocondrias, el fármaco antitumoral Cur sirvió como núcleo hidrófobo, el receptor CD44 dirigido a oHA funcionó como una capa hidrófila y el enlace disulfuro actuó como un brazo de conexión. La estructura química de TPP-oHA-S-S-Cur se caracterizó por 1 Tecnología HNMR. Se cargó Cur en las micelas TPP-oHA-S-S-Cur por autoensamblaje. Se estudiaron algunas propiedades, incluida la preparación de micelas, la morfología, la sensibilidad redox y el direccionamiento mitocondrial. Los resultados mostraron que las micelas de TPP-oHA-S-S-Cur tenían un diámetro medio de 122,4 ± 23,4 nm, potencial zeta - 26,55 ± 4,99 mV. El estudio de liberación in vitro y la prueba de absorción celular mostraron que las micelas de TPP-oHA-S-S-Cur tenían sensibilidad redox, doble focalización en el receptor mitocondrial y CD44. Este trabajo proporcionó una plataforma nanoportadora multifuncional inteligente prometedora para mejorar la solubilidad, disminuir los efectos secundarios y mejorar la eficacia terapéutica de los medicamentos contra el cáncer.

Antecedentes

En los últimos años, con el fin de lograr el tratamiento eficaz del cáncer, se estudiaron muchos sistemas de administración de fármacos [1] para preparar portadores de fármacos poliméricos macromoléculas multifuncionales con modificaciones estructurales que podrían tener muchas ventajas, como mejorar la biodisponibilidad de los fármacos al reducir su tasa de degradación. , mejorando la captación celular, permitiendo la focalización y el control de la liberación del fármaco, y reduciendo los efectos secundarios [2, 3].

La curcumina (Cur), un compuesto difenólico, se aisló de una medicina tradicional china Curcuma longa . En comparación con los fármacos antitumorales generales, Cur tuvo amplios efectos antitumorales en muchos tumores como el cáncer de próstata, mama y colon, y esa citotoxicidad relativamente menor [4]. Pero su inadecuada solubilidad, inestabilidad y escasa biodisponibilidad limitan extremadamente su aplicación clínica [5, 6]. Para mejorar la solubilidad y biodisponibilidad de los fármacos hidrófobos, se han fabricado muchos nanomateriales bien diseñados mediante la incorporación de fármacos hidrófobos y ácido hialurónico oligomérico (oHA) de material hidrófilo [7]. Diseñamos una especie de conjugados anfipáticos de polímero-fármaco como nanoportador al cargar curcumina en micelas de polímero mediante el autoensamblaje, que tenía una buena estabilidad y puede prolongar la vida media del fármaco en la circulación sanguínea. Las micelas con un tamaño de partícula pequeño pueden acumularse pasivamente en un tumor sólido a través del efecto EPR de la angiogénesis tumoral de manera efectiva para lograr un mejor efecto del tratamiento [8, 9].

oHA, una pequeña molécula derivada de la degradación de HA, posee propiedades únicas, como buena hidrofilia, biocompatibilidad, estabilidad en el plasma y orientación al receptor CD44 en la superficie de la célula [7, 10, 11], mientras que los receptores CD44 están sobreexpresados en células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama, en comparación con una expresión más baja en las células normales [12]. Las células tumorales tienen señales celulares únicas, que incluyen glutatión (GSH, 2–10 mM), pH bajo y algunas enzimas, en contraste con las células humanas normales [13,14,15,16,17,18,19,20 ], mientras que los enlaces disulfuro tienen sensibilidad a la reducción y podrían fracturarse bajo la acción del GSH reducido en el citoplasma [21, 22].

Las mitocondrias son los orgánulos vitales para la supervivencia celular y juegan un papel importante en la producción de energía y en las vías apoptóticas [23,24,25,26,27]. Por lo tanto, las mitocondrias se han considerado durante mucho tiempo como los objetivos subcelulares aplicados para el tratamiento del cáncer en los informes anteriores [28]. Debido al mayor potencial de membrana de las mitocondrias entre los orgánulos celulares, trifenilfosfina, trifenilmetilfosfonio y otros tipos de cationes lipofílicos pueden enriquecerse fácilmente en las mitocondrias a través de su barrera hidrofílica de bicapa lipídica [29, 30].

En este trabajo, con el fin de mejorar la solubilidad de Cur y mejorar la especificidad para las células cancerosas, se diseñaron y sintetizaron conjugados polímero-fármaco, compuestos de oHA, TPP, enlaces disulfuro y Cur, que se dirigieron específicamente al receptor CD44 y las mitocondrias. . Además, tenía sensibilidad a la reducción y se puede utilizar como marcador de fluorescencia. Este nuevo nanoportador multifuncional recibió su nombre de bromuro de (5-carboxipentil) trifenilfosfonio, ácido hialurónico oligomérico, enlace disulfuro y curcumina (TPP-oHA-S-S-Cur). Se cargó Cur en micelas de TPP-oHA-S-S-Cur mediante el autoensamblaje en agua [1, 31]. Las micelas poliméricas TPP-oHA-S-S-Cur encapsuladas Cur (en lo sucesivo denominadas micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur) podrían mejorar la eficacia terapéutica y la carga de fármaco de la curcumina, así como reducir los efectos secundarios. Después de dirigirse a los tejidos tumorales, las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur penetraron en las células a través de la endocitosis mediada por CD44, seguida de la orientación a las mitocondrias y los enlaces disulfuro se rompieron en respuesta a un alto GSH (2 a 10 mM) que condujo a la liberación rápida del fármaco (Fig. 1). En este documento, podemos proponer la hipótesis de que estas nanopartículas multifuncionales sensibles a redox de doble dirección mitocondrial y receptor CD44 novedosas serán una nueva plataforma para el sistema de administración de fármacos dirigidos a tumores. Después de preparar las micelas, en este estudio se llevaron a cabo algunas investigaciones preliminares sobre las características de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur.

Ilustración esquemática de nanopartículas sensibles a redox de doble direccionamiento mitocondrial y del receptor CD44

Métodos

Materiales

Curcumina (Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); ácido hialurónico oligomérico (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); El ácido 3,3'-ditiodipropiónico fue proporcionado por Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Bromuro de (5-carboxipentil) trifenilfosfonio (TPP), tetrahidrofurano anhidro (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), trietilamina (TEA), 1-etil- (3-dos metil aminopropil) carbodiimida carbonizada hidrocloruro (EDC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) se obtuvieron de Aladdin Chemistry Co. Ltd. Todos los demás reactivos eran de grado analítico y fueron suministrados por Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.

Síntesis y caracterización de TPP-oHA-S-S-Cur

Los nanoportadores multifuncionales se sintetizaron con tres pasos, como se muestra en la Fig. 2.

Ruta sintética de TPP-oHA, S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur

Paso 1

TPP se combinó con oHA a través de un enlace éster utilizando un método informado anteriormente [32]. Primero, se disolvieron TPP, EDC y DMAP en DMSO para reaccionar durante 1 ha 60 ° C. Luego, se disolvió oHA en DMSO:H 2 O ( v / v =1:1) y se le añadió la reacción anterior durante 8 ha temperatura ambiente. La mezcla de reacción se dializó con una bolsa de diálisis (MWCO 2000 Da) en agua desionizada durante 48 h para eliminar las impurezas y se liofilizó para obtener polímeros TPP-oHA.

Paso 2

Brevemente, se disolvió ácido 3,3'-ditiodipropiónico en THF y se activó con cloruro de oxalilo. Luego, la mezcla se hizo reaccionar con Cur catalizada por TEA. El producto obtenido se aisló mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el producto puro S-S-Cur.

Paso 3

Se disolvieron S-S-Cur, EDC y DMAP en DMSO y se activaron a 60 ° C durante 2 h, y luego se añadió TPP-oHA en la solución anterior y se hizo reaccionar durante 24 ha temperatura ambiente. La mezcla se dializó en agua destilada con tubo de diálisis (MWCO 2000 Da) durante 48 h, seguido de liofilización para obtener el producto final TPP-oHA-S-S-Cur.

Las estructuras de TPP-oHA, S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur se confirmaron con 1 HNMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, EE. UU.) Con DMSO-d 6 deuterado , CD 3 Cl y DMSO-D 6 :D 2 O (DMSO-d 6 :D 2 O =1:1, v / v ) como disolvente, respectivamente.

Preparación y caracterización de micelas

Las micelas TPP-oHA-S-S-Cur y las micelas oHA-Cur se prepararon mediante métodos de diálisis [33]. En primer lugar, se disolvieron TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) y curcumina (1,5 mg) en formamida (6 ml). Luego, la mezcla se dializó en agua desionizada con bolsa de diálisis (MWCO 2000 Da) en oscuridad durante 24 h para remover los solventes orgánicos. Después de eso, la solución dializada se centrifugó a 2500 rpm durante 10 min para eliminar el Cur. Finalmente, la suspensión de micelas se filtró a través de membranas de filtro de jeringa de 0,45 µm. Las micelas funcionales simples de oHA-Cur se obtuvieron por el mismo método.

El tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (P.I.) de las micelas cargadas con Cur fueron observados por Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.). La morfología de las micelas cargadas con Cur se controló mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japón). La estabilidad de las micelas cargadas con Cur se llevó a cabo en PBS que contenía FBS al 20% mediante Delsa Nano C.

La eficiencia de atrapamiento (EE) y la carga de fármaco (DL) se midieron mediante el método de filtración por membrana. Después de filtrar por membrana de 0,45 μm, la solución obtenida se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Agilent Technologies) a 425 nm para obtener EE y DL. Las ecuaciones para calcular EE y DL de las micelas fueron las siguientes:

$$ \ mathrm {EE} \ left (\% \ right) =\ mathrm {Cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {fármaco} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {micelles} / \ mathrm {total } \ \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {alimentación} \ \ mathrm {droga} \ veces 100 $$ $$ \ mathrm {DL} \ left (\% \ right) =\ mathrm {Cantidad } \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {fármaco} \ \ mathrm {en} \ \ mathrm {micelles} / \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {fármaco} \ \ mathrm {cargado} \ \ mathrm {micelles} \ times 100 $$

Liberación de fármacos in vitro en presencia de GSH

La respuesta redox intracelular de GSH de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur se evaluó utilizando el método de diálisis. Se colocaron cuatro mililitros de las suspensiones de micelas de Cur / TPP-oHA-SS-Cur (50 μg de curcumina / ml) en una bolsa de diálisis (MWCO 7000 Da) y se dializaron frente a 45 ml de PBS (pH 7,4, que contenía suero bovino fetal al 45%). y Tween 80 al 0,5%) con diferentes niveles de GSH (0, 10, 2 y 10 mM). Las muestras en tubos de centrífuga se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora con agitador (BS-2F, Changzhou, China) a 100 rpm. A intervalos de tiempo predefinidos (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h), se tomaron 2 ml de medio de liberación de los tubos de centrífuga y se rellenaron con un volumen igual de Los medios frescos correspondientes y las concentraciones de Cur se analizaron por HPLC. Cada experimento se realizó por triplicado.

Cultivo celular

Se cultivaron células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Hyclone) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%. Los receptores CD44 tenían una alta expresión en las células MDA-MB-231, por lo que se seleccionaron las líneas celulares MDA-MB-231 y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de CO 2 atmósfera complementada.

Ensayos de citotoxicidad in vitro

El ensayo de citotoxicidad in vitro de TPP-oHA-S-S-Cur se evaluó mediante el método MTT [32]. Se cultivaron células MDA-MB-231 (receptor CD44 de alta expresión) a una densidad de 1 × 10 4 células / pocillo en placas de 96 pocillos. Cien microlitros de micelas Cur, Cur / oHA-Cur libres y micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur, incluidas diferentes concentraciones de Cur (0.5, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 y 40 μg / mL) fueron añadido a diferentes pocillos, mientras que se añadió PBS como control. Luego de ser incubados por 24 h, se agregaron 100 μL de solución de MTT (5 mg / mL) a cada pocillo y luego se incubaron por 4 h. Luego, se reemplazó el MTT por 100 μL de DMSO y se colocaron en una incubadora con agitador para disolver el cristal de formazán. Después de incubar durante 20 minutos, se midió la absorbancia utilizando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) a 570 nm.

Captación celular in vitro y localización mitocondrial

Se observaron análisis cualitativos de la absorción celular de micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur y micelas Cur / oHA-Cur utilizando microscopía de fluorescencia (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japón). Las células MDA-MB-231 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5000 células por pocillo y se incubaron con DMEM (1 ml) que contenía FBS al 10% y luego se cultivaron durante 24 ha 37 ° C en CO al 5%. 2 . Después de eso, se añadió medio de cultivo fresco (1 ml) con micelas cargadas con fármaco (micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur y micelas Cur / oHA-Cur) en cada pocillo. Las células se cultivaron con Cur libre que actuó como control; la concentración final de Cur fue de 20 μg / mL. Además, las células se incubaron con fármaco durante diferentes intervalos de tiempo. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min.

Además, para evaluar la capacidad de direccionamiento de CD44 de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur, se añadió HA (2 mg / ml) al medio como grupo de control para unirse a los receptores CD44.

Además, para etiquetar las mitocondrias celulares para localizar las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur y las micelas Cur / oHA-Cur dentro de las células, las células se incubaron con un rastreador mitocondrial (Mito-tracker Red CMXROS) durante 15 min. Finalmente, las células se lavaron tres veces y se observaron mediante microscopía de fluorescencia.

Citometría de flujo

Los análisis cuantitativos se midieron mediante citometría de flujo. Se sembraron células MDA-MB-231 en placas de seis pocillos a una densidad de 10 5 células / pocillo en 2 ml de medio con FBS al 10% y se tratan como la descripción anterior. Después de la incubación con micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur y micelas Cur / oHA-Cur (20 μg Cur / mL) durante diferentes intervalos de tiempo, las células se lavaron tres veces con PBS y se tripsinizaron con tripsina al 0,25%. Luego, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Después de la resuspensión en PBS (0,5 ml), las células se analizaron mediante citometría de flujo (EPICS XL, Beckman, EE. UU.).

Análisis estadístico

Los datos se presentaron como medias ± DE ( n =3). Además, se utilizó el software SPSS (ver. 20, EE. UU.); los datos se analizaron en busca de diferencias significativas a niveles de probabilidad de * p <0.05 (significativo) usando análisis de variación unidireccional (ANOVA).

Resultados y discusión

Caracterización de materiales portadores TPP-oHA-S-S-Cur

Las rutas de síntesis de TPP-oHA, S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur se presentan en la Fig. 2.

Además, el 1 Los espectros de HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur se observaron en la Fig. 3. TPP-oHA fue sintetizada por TPP y oHA. Se observaron picos característicos de tres anillos de benceno en TPP a 7.570–7.717 ppm en el 1 Espectro HNMR de TPP-oHA, que confirmó que TPP-oHA se sintetizó con éxito. Además, S-S-Cur fue sintetizado por ácido 3,3′-ditio-dipropiónico y Cur. Además, TPP-oHA-S-S-Cur fue sintetizado por TPP-oHA y S-S-Cur. El TPP en TPP-oHA-S-S-Cur se observó en la región entre 7.570 y 7.717 ppm. Los picos característicos de Cur se observaron en el 1 Espectro HNMR de S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur a 6.795–7.467 ppm, y el pico de protones (-CH 2 -S-S-CH 2 -) de ácido 3,3-ditiodipropiónico se observó a 2,502 ppm de acuerdo con TPP-oHA-S-S-Cur. Estos resultados confirmaron la síntesis exitosa de TPP-oHA-S-S-Cur.

1 Espectros HNMR de oHA, TPP-oHA, S-S-Cur y TPP-oHA-S-S-Cur

Preparación y evaluación de las micelas TPP-oHA-S-S-Cur

El tamaño de partícula, índice de polidispersidad, potenciales zeta, DL y EE de las micelas cargadas con fármaco se muestran en la Tabla 1. Los tamaños medios de las micelas Cur / oHA-Cur y de las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur fueron 145,5 ± 2,1 y 122,4 ± 4,6 nm, respectivamente. Esto podría deberse a que TPP cambió las propiedades fisicoquímicas de la superficie de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur que conducen a las diferencias de dos micelas. Y la DL y EE de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur fueron más altas que las micelas ordinarias preparadas por TPP-oHA. Además, las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur tenían un potencial zeta negativo más fuerte (- 21,56 ± 1,46 mV) que el de las micelas Cur / oHA-Cur (- 19,17 ± 0,55 mV), lo que indicaba una mayor estabilidad de TPP-oHA -SS-Cur debido a la agregación de micelas causada principalmente por la presencia de TPP.

Además, la apariencia, la distribución del tamaño de partícula, el potencial zeta y la caracterización de la imagen TEM de las micelas TPP-oHA-SS-Cur se muestran en la Fig. 4. Los resultados revelaron que las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur eran aproximadamente esféricas ( Fig. 4d), distribuida homogéneamente (Fig. 4b), y tenía un diámetro medio de aproximadamente 122,4 ± 4,6 nm. Además, el índice de polidispersidad de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur fue 0,132 menor que 0,2, lo que indica la uniformidad del tamaño de las micelas, que era consistente con TEM (Fig. 4c).

Apariencia ( a ), distribución del tamaño de partículas ( b ), potencial zeta ( c ) e imagen TEM ( d ) caracterización de micelas TPP-oHA-S-S-Cur

Como se muestra en la Tabla 1, el tamaño de partícula de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur fue menor en PBS que en PBS que contenía FBS. De 2 a 24 h, el tamaño había cambiado de 133,45 ± 6,8 a 160,27 ± 7,1 nm en PBS que contenía FBS. Este fenómeno indicó que las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur podrían mantener una mejor estabilidad in vivo.

Estudio sobre liberación de micelas in vitro de fármacos

La sensibilidad redox de TPP-oHA-S-S-Cur se estudió mediante micelas en diferentes concentraciones de GSH. Se llevó a cabo la liberación de Cur de las micelas de Cur / TPP-oHA-S-S-Cur en presencia o ausencia de GSH para simular los entornos tumorales. Como se muestra en la Fig.5, en el medio sin GSH, solo el 32.5% de Cur se liberó del TPP-oHA-SS-Cur dentro de las 120 h, y la adición de 10 μM de GSH al medio solo resultó en un leve aumento (37%) . Por el contrario, la liberación de fármaco de los grupos con GSH 2 mM y GSH 10 mM fue 57,5 ​​y 75,3%, respectivamente. Se verificó que la liberación del fármaco aumentaba con la concentración de GSH. Este resultado se atribuyó a la ruptura del enlace disulfuro de TPP-oHA-S-S-Cur, lo que indicó que las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur tenían sensibilidad a la reducción.

Liberación in vitro de micelas de TPP-oHA-S-S-Cur cargadas con Cur a diferentes concentraciones de GSH ( n =3)

Estudios de citotoxicidad

La citotoxicidad de diferentes formulaciones de curcumina en células MDA-MB-231 se estudió mediante ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 6, diferentes concentraciones de formulaciones de curcumina tenían una viabilidad celular diferente a las 24 h. Las micelas cargadas con Cur fueron menos tóxicas que el Cur libre, lo que podría explicarse que el material polimérico disminuyó en gran medida la citotoxicidad celular. Mientras tanto, la Fig.6b mostró un perfil de viabilidad celular dependiente de la concentración, mientras que las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur tenían la viabilidad celular más baja que las micelas Cur / oHA-Cur y otras formulaciones, lo que podría explicarse que Cur / TPP- Las micelas de oHA-SS-Cur pudieron entrar fácilmente en las células y liberar el fármaco bajo el efecto de GSH. El IC 50 Los valores de las micelas Cur, Cur / oHA-Cur libres y de las micelas Cur-TPP-oHA-SS-Cur en las células MDA-MB-231 fueron 6.534, 5.092 y 3.871 μg / mL, respectivamente, que exhibieron una mejor citotoxicidad celular de Cur -TPP-oHA-SS-Cur micelas en células MDA-MB-231.

un Citotoxicidad de formulaciones de curcumina después de incubación durante 24 h. Los datos representan la media ± DE ( n =6). * p <0.05, comparado con el Cur libre. b Citotoxicidad de micelas cargadas de Cur con diferentes concentraciones de Cur (0.5, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 y 40 μg / mL). El IC 50 los valores de las micelas Cur, Cur / oHA-Cur libres y Cur-TPP-oHA-SS-Cur fueron 6.534, 5.092 y 3.871 μg / mL, respectivamente

Además, las micelas en blanco tenían cierta toxicidad (Fig. 6) porque el Cur estaba unido al polímero mediante un método químico. Esto aumentaría la capacidad de carga de fármaco de las micelas y luego mejoraría el efecto antitumoral.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de la captación celular

La captación celular de las micelas Cur, Cur / oHA-Cur libres y las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur se estudiaron mediante microscopio de fluorescencia. En este trabajo, Cur en sí mismo no solo era un medicamento contra el cáncer, sino también una sonda de fluorescencia verde. Como se ve en la Fig.7, tanto las micelas Cur / oHA-Cur como las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur mostraron una buena captación celular en las líneas celulares y la intensidad de la fluorescencia fue directamente proporcional al tiempo, mientras que la intensidad de la fluorescencia fue más fuerte en 4 h. Mientras tanto, la intensidad de fluorescencia del grupo tratado con micelas de Cur / oHA-Cur fue más fuerte que el grupo de Cur libre en los mismos puntos de tiempo. Esto podría deberse a que oHA-Cur con la capacidad de dirigirse al receptor CD44 promovió la entrada de fármacos en las células. Además, tal vez gracias a la capacidad de sensibilidad redox de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur, sus señales de fluorescencia eran obviamente más altas que las micelas Cur / oHA-Cur. Al mejorar la acumulación de Cur, sería inducida por la citotoxicidad y la apoptótica de las células cancerosas, que coincidían con los resultados de los estudios de citotoxicidad.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de la captación celular de Cur ( a ), oHA-Cur / Cur-micelas ( b ) y TPP-oHA-S-S-Cur / Cur-micelles ( c ) en un momento diferente. d Células tratadas con TPP-oHA-S-S-Cur / Cur-micelas en presencia de HA libre (2 mg / mL), que muestran el efecto de finalización de HA en células MDA-MB-231

Además, la intensidad de fluorescencia del grupo de micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur con HA fue menor que sin el grupo HA, probablemente debido al hecho de que las moléculas de HA libres preocuparon a los receptores CD44, que demostraron además la capacidad de direccionamiento. del TPP-oHA-SS-Cur contra CD44.

Además, la localización mitocondrial de TPP-oHA-S-S-Cur se confirmó en líneas celulares MDA-MB-231 mediante tinción con Mito-tracker Red CMXRos (Fig. 8). Las imágenes revelaron que la fluorescencia verde de las micelas Cur / TPP-oHA-SS-Cur superponía muy bien a la fluorescencia roja del rastreador mitocondrial, lo que indicaba que el fármaco podría acumularse en las mitocondrias de las células cancerosas y el TPP-oHA-SS. -Cur tenía un objetivo mitocondrial.

Localización mitocondrial. La localización mitocondrial se determinó mediante tinción con rastreadores mitocondriales en células MCF-7 con el tratamiento de Cur ( a libre) ), oHA-Cur ( b ) y TPP-oHA-S-S-Cur ( c ); barra de escala:100 μm

Citometría de flujo

La intensidad fluorescente media (MFI) se midió con citometría de flujo. Como se ve en la Fig. 9, el MFI de las células MDA-MB-231 incubadas con micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur y micelas Cur / oHA-Cur fue directamente proporcional al tiempo de administración. De acuerdo con la observación microscópica confocal, el MFI de las células tratadas con micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur fue significativamente mayor que el grupo de micelas Cur / oHA-Cur en los mismos puntos de tiempo ( p <0.05).

Intensidad de fluorescencia de células MDA-MB-231 incubadas con diferentes formulaciones de Cur (20 μg Cur / mL). Datos representados como media ± DE ( n =3). * p <0.05, ANOVA unidireccional

Conclusiones

En este estudio, para mejorar la solubilidad y el efecto del tratamiento de Cur, reducir los efectos secundarios de la terapia tradicional y aumentar la focalización del fármaco en el tumor, tomamos un enlace disulfuro sensible a redox como un brazo de conexión y construimos un receptor CD44 y mitocondrial de doble focalización. conjugados polímero-fármaco que responden a redox (TPP-oHA-SS-Cur). El TPP se dirigió a las mitocondrias, el fármaco antitumoral Cur sirvió como resto hidrófobo y el receptor CD44 dirigido a oHA actuó como restos hidrófilos. Cur, como fármaco modelo, se cargó en el copolímero de bloques anfifílico y formó micelas mediante el autoensamblaje.

Este sistema de administración de fármacos que encapsula Cur por un método químico y un método físico no solo mejora su DL / EE, sino que también aumenta su estabilidad y tiempo de circulación sanguínea, y podría lograr una mejor focalización del tumor. Las pruebas de liberación de fármacos in vitro mostraron que el enlace disulfuro de TPP-oHA-SS-Cur se rompió por el efecto de alto GSH (2–10 mM) en las células tumorales, seguido de la liberación rápida del fármaco y luego demostró su reducción. sensitivo. Los resultados de la captación celular, la localización mitocondrial y la citotoxicidad mostraron que las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur tenían la capacidad de dirigirse al receptor CD44 y la capacidad de dirigirse a las mitocondrias. En el siguiente paso, evaluaremos la actividad antitumoral de las micelas Cur / TPP-oHA-S-S-Cur in vivo.

Además, esta plataforma nanoportadora multifuncional inteligente desarrollada en este estudio exhibió potencial para ser utilizada para fármacos hidrófobos con una solubilidad, estabilidad y eficacia terapéutica significativamente mejoradas. Mientras tanto, este método proporcionó una nueva idea para el tratamiento de tumores.

Abreviaturas

oHA:

Ácido hialurónico oligomérico

S-S-Cur:

Ácido ditiodipropiónico-curcumina

TPP:

Bromuro de (5-carboxipentil) trifenilfosfonio


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