Decodificación de los genomas del SARS-CoV-2 - Pruebas de diagnóstico

"¡Probando, probando, probando!" es un eslogan ampliamente promocionado para controlar la pandemia de COVID-19. La Organización Mundial de la Salud y otras agencias federales / estatales de todo el mundo han publicado este eslogan familiar. De hecho, analizar rápidamente las poblaciones humanas es la piedra angular para controlar una pandemia como COVID-19.

Las pruebas exhaustivas proporcionan una base racional para implementar estrategias de salud pública que pueden prevenir una mayor propagación de la enfermedad. Permite a las autoridades tomar decisiones informadas sobre políticas de mitigación como el distanciamiento social, la permanencia en el hogar y, en casos extremos, el toque de queda. A raíz de una enfermedad transmitida por el aire como COVID-19, estas iniciativas cruciales de salud pública son vitales para reducir la presión sobre los sistemas de atención médica y salvar vidas humanas.

El análisis basado en el genoma es la clave para diseñar un kit de prueba específico para el SARS-CoV-2. Este es el caso tanto si estamos diseñando kits basados ​​en ADN (PCR, amplificación isotérmica, CRISPR) como si estamos generando antígenos para la detección serológica . Una organización mundial sin fines de lucro ha recopilado una lista de todas las pruebas de SARS-CoV-2 que están disponibles comercialmente. Aquí discutiremos las dos técnicas principales que se utilizan actualmente:pruebas basadas en ADN y pruebas basadas en anticuerpos.

Pruebas basadas en ADN

Las pruebas actuales de COVID-19 realizadas en material genético viral de hisopos de nariz y garganta utilizan una técnica de biología molecular común llamada Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Otra prueba emplea la tecnología de amplificación de ácido nucleico isotérmica más reciente desarrollada por Abbot Labs ¹ . Ambas pruebas son muy sensibles. Funcionan amplificando una región del genoma que es específica del virus SARS-CoV-2. Esta amplificación está preparada por un par de oligonucleótidos (también llamados cebadores) que son complementarios a las secuencias virales.

El método actual de RT-PCR incluye la extracción de ARN viral de hisopos de nariz y garganta y la transcripción inversa del ARN a ADN, seguida de una reacción de PCR. El método de PCR utiliza una estrategia de ciclos de temperatura que implica desnaturalizar la plantilla y hibridar cebadores cortos con secuencias complementarias en la plantilla. La extensión del complejo cebador-molde, facilitada por la enzima polimerasa, conduce a una amplificación exponencial de los amplicones diana. Los resultados se obtienen en unas pocas horas. La OMS y los CDC comparten protocolos detallados sobre el método de PCR. Por el contrario, el método isotérmico de Abbott labs no está limitado por la restricción del ciclo térmico y los resultados positivos para COVID-19 se obtienen en 5 minutos, mientras que los resultados negativos se obtienen en 13 minutos ¹ .

Las regiones únicas en el SARS-CoV-2 identificadas mediante análisis comparativos del genoma sirven como marcadores distintivos para diseñar cebadores o sondas que se utilizan en kits basados ​​en ADN. El SARS-CoV-2 es un virus de ARN monocatenario con un genoma de casi 30.000 bases. El genoma viral codifica cuatro proteínas estructurales, a saber, la envoltura (E), la membrana (M), la nucleocápside (N) y las proteínas de la espiga (S).

Los análisis comparativos del genoma han identificado diferentes regiones exclusivas del SARS-CoV-2. La singularidad de la secuencia se valida mediante la búsqueda de secuencias similares utilizando el algoritmo BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica) en la base de datos GenBank, un depósito global de todos los genomas secuenciados. Las regiones únicas en genes como ORF1ab, N, RdRp y S se utilizan actualmente como cebadores en el diagnóstico de RT-PCR de SARS-CoV-2 ² , mientras que la prueba rápida ID NOW ™ COVID-19 de Abbott se dirige al gen RdRp.

Nuevos métodos en el horizonte

CRISPR, una popular tecnología de edición de genes, se considera una opción escalable para las pruebas de población. Este método utiliza la capacidad de la maquinaria CRISPR para reconocer secuencias genéticas específicas y cortarlas. CRISPR también corta una molécula informadora agregada a la reacción que puede revelar rápidamente la presencia de material genético viral. El SHERLOCK (Desbloqueo específico de reportero enzimático de alta sensibilidad) basado en CRISPR se describe como un método de tira reactiva de papel que puede producir resultados en una hora. SHERLOCK fue co-desarrollado por Feng Zhang del Broad Institute of MIT y Harvard ³ . Otro método desarrollado por Jennifer Doudna en la Universidad de California, Berkeley, usurpa la preamplificación isotérmica con ADN Endonucleasa Targeted CRISPR Trans Reportero (DETECTR) para coronavirus. DETECTR puede proporcionar resultados en 30 minutos ⁴ .

Los métodos basados ​​en secuencia proporcionan información crítica sobre la presencia o ausencia del virus en un paciente, información que es especialmente valiosa al desarrollar políticas de salud y seguridad públicas. En los EE. UU., Actualmente solo evaluamos a personas que presentan síntomas de COVID-19. Sin embargo, con una enfermedad como COVID-19 existe una seria amenaza de que personas asintomáticas puedan estar propagando el virus en la comunidad.

¿Cómo sabemos si una persona ya ha tenido la infección por SARS-CoV-2 y ha desarrollado inmunidad?

Pruebas basadas en anticuerpos

La prueba de anticuerpos identifica a los individuos asintomáticos que ya han tenido una infección y probablemente sean inmunes. La prueba de anticuerpos también es la mejor estrategia para evaluar a toda la población y aliviar el miedo a la propagación en la comunidad. Las personas con resultados positivos de anticuerpos también podrían ser una fuente potencial de plasma que se puede inyectar en pacientes con COVID-19, un enfoque que se está probando actualmente en los EE. UU.

Las pruebas de anticuerpos requieren cierto conocimiento de las proteínas que son cruciales para el virus, por ejemplo, la proteína de la cubierta viral. Idealmente, las proteínas virales que activan el sistema inmunológico son las mejores candidatas, porque inician la producción de anticuerpos que marcan o neutralizan el virus. Entonces es necesario producir esas porciones o secciones de la proteína viral en el laboratorio y transfectarlas en líneas celulares para su inclusión en un inmunoensayo como ELISA que detecta la presencia de anticuerpos.

Dichos inmunoensayos pueden potencialmente formar la base de los kits de prueba caseros para detectar inmunidad a enfermedades como COVID-19. Sin embargo, desarrollar estos kits lleva tiempo. El cuello de botella más desafiante en este proceso es expresar la proteína o el segmento de proteína en la conformación correcta.

La proteína de pico SARS-CoV-2 presenta una vía potencial para el desarrollo de diagnósticos ya que tiene pocas regiones únicas. Varios equipos están probando el dominio de unión al receptor de la proteína S, mientras que algunos están investigando la proteína de pico completa ² . Otros candidatos potenciales incluyen la proteína nucleocápside y la proteína S. La FDA está evaluando diferentes métodos de prueba de anticuerpos y recientemente aprobó la primera prueba, que ayudará a determinar cuántas personas de la población tienen inmunidad ⁵ .

En medio de la pandemia actual de COVID-19, las pruebas de diagnóstico basadas en ADN y anticuerpos están marcando una diferencia crucial en las iniciativas de salud pública que adoptamos para contener y mitigar el virus SARS-CoV-2. A medida que nos esforzamos por "aplanar la curva", las pruebas rápidas son importantes.

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El modelado y la simulación proponen nuevos conocimientos para el SARS-CoV-2 Decodificación de los genomas del SARS-CoV-2 - Origen